強(qiáng)骨膠囊對(duì)去勢(shì)后小鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響

笪巍偉唐德志金鎮(zhèn)雄趙永見馬 勇施 杞王擁軍

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032；2.揚(yáng)州市中醫(yī)院骨傷科，江蘇 揚(yáng)州 225000；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032；4.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是最為常見的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥之一，更年期婦女作為高危人群發(fā)病率可達(dá)25%～50%［1］，且隨年齡增長(zhǎng)而呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，由于其發(fā)病隱匿，伴有骨痛、駝背等癥狀，潛在的脊柱及髖部等部位骨折風(fēng)險(xiǎn)高于男性，因此，中老年婦女的健康、經(jīng)濟(jì)、生活等方面均受到嚴(yán)重威脅［2］。骨質(zhì)疏松性骨折在圍手術(shù)期或傳統(tǒng)治療的同時(shí)，均需積極聯(lián)合原發(fā)病的干預(yù)。藥物是最為常用的有效方法，國內(nèi)中成藥繁多，其中強(qiáng)骨膠囊是目前臨床上常用于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松性骨折防治的中藥二類新藥，并被世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦為代表性中成藥［3］，具有補(bǔ)腎、強(qiáng)骨、止痛之功。本研究旨在分析強(qiáng)骨膠囊在骨質(zhì)疏松性骨折治療中的效果，為該藥臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 3 月齡C57BL／6 雌鼠36 只，清潔級(jí)，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001［4］，20～25 ℃，12 h 光照，相對(duì)濕度為40%～70%。依據(jù)上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)規(guī)定進(jìn)行動(dòng)物研究。

1.2 試劑與藥物 強(qiáng)骨膠囊（北京岐黃醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20030007）主要成分為骨碎補(bǔ)總黃酮，每粒膠囊0.25 g，內(nèi)容物為棕紅色至棕褐色粉末，取適量加入蒸餾水制成對(duì)應(yīng)濃度混懸液。蘇木精-伊紅（南京建成科技有限公司）；Alcian Blue 8GX、Eosin Y、Orange G、Phloxine B、萘酚AS-BI 磷酸溶液、sodium iodate 碘酸鈉均購自美國Sigma 公司。

1.3 儀器 TPP2020 組織脫水機(jī)（德國Leica 公司）；VS120-SL 全片組織掃描儀（日本Olympus 公司）；EG1160全自動(dòng)石蠟包埋機(jī)（德國Leica 公司）；uCT80 Micro-CT（瑞士Scanco Medical 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 36 只小鼠隨機(jī)區(qū)組法分為生理鹽水組、強(qiáng)骨膠囊組（0.107 g／kg），每組18 只，第7、14、28 天各6 只。建立去勢(shì)后小鼠復(fù)合脛骨骨折模型［4］，術(shù)后24 h 胃內(nèi)給藥，分別予給強(qiáng)骨膠囊、生理鹽水灌胃，并按照3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行影像學(xué)及病理組織學(xué)觀察［4］。

2.2 血清雌二醇（estradiol，E2）檢測(cè)放射免疫法檢測(cè)［4］。

2.3 影像學(xué)檢測(cè) uCT80 Micro-CT 對(duì)左側(cè)脛骨進(jìn)行X-ray掃描、三維重建及形態(tài)計(jì)量學(xué)分析［4］。

2.4 病理組織學(xué)染色 HE、ABH／OG 染色，具體方法見文獻(xiàn)［4］。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPASS 18.0 軟件進(jìn)行分析計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間的比較使用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 強(qiáng)骨膠囊對(duì)小鼠血清E2 水平的影響 28 d 后，強(qiáng)骨膠囊組E2 水平高于生理鹽水組（P＜0.01），說明強(qiáng)骨膠囊能夠增加去勢(shì)后雌激素水平，改善去勢(shì)后骨量丟失的進(jìn)展，見表1。

表1 強(qiáng)骨膠囊干預(yù)28 d 對(duì)小鼠血清E2 水平的影響（±s）

表1 強(qiáng)骨膠囊干預(yù)28 d 對(duì)小鼠血清E2 水平的影響（±s）

注：與生理鹽水組比較，??P＜0.01。

3.2 強(qiáng)骨膠囊促進(jìn)斷端愈合的影像學(xué)變化

3.2.1 2 組骨折愈合過程的X-Ray 表現(xiàn) 給藥7 d，2 組骨折斷端無明顯差異；給藥14 d，生理鹽水組骨折斷端骨痂影稀少，強(qiáng)骨膠囊組可見大量骨痂影，越過斷端；給藥28 d，生理鹽水組骨折部位尚未完全愈合，斷端模糊，強(qiáng)骨膠囊組骨折斷端已愈合，連續(xù)性完好，見圖1。骨痂Micro-CT 三維重建圖顯示，強(qiáng)骨膠囊組3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的骨痂體積、骨小梁數(shù)量及骨折愈合的完整性均優(yōu)于生理鹽水組，見圖2，提示強(qiáng)骨膠囊能夠有效促進(jìn)損傷部位骨痂的形成和重塑，加速骨折愈合。

圖1 骨折X-Ray 變化

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)骨痂三維重建

3.2.2 骨痂Micro-CT 定量分析 給藥7 d，與生理鹽水組比較，強(qiáng)骨膠囊組可提高骨痂的骨小梁連接密度（Conn.D.）（P＜0.01）；給藥14 d，與生理鹽水組比較，強(qiáng)骨膠囊組骨痂中骨小梁體積比（BV／TV）和骨密度BMD（TV）增加（P＜0.05）；給藥28 d，強(qiáng)骨膠囊組總骨組織密度BMD（BV），以及骨折愈合部位的剛度、彈性模量均高于生理鹽水組（P＜0.05），見表2～5。因此，強(qiáng)骨膠囊有利于增加骨痂及骨組織的密度，改善骨折愈合后的力學(xué)性能。

3.3 強(qiáng)骨膠囊促進(jìn)斷端愈合的HE／ABHO 染色觀察

3.3.1 HE 染色 強(qiáng)骨膠囊組7、14 d 時(shí)可促進(jìn)斷端部位骨痂的大量形成、重塑，28 d 時(shí)多余的骨痂組織被重吸收，骨髓腔再通，骨折部位愈合后連續(xù)性完好，而生理鹽水組3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)骨折斷端愈合的進(jìn)程明顯滯后于強(qiáng)骨膠囊組，見圖3。

表2 干預(yù)7 d 脛骨骨痂Micro-CT（±s）

表2 干預(yù)7 d 脛骨骨痂Micro-CT（±s）

注：與生理鹽水組比較，??P＜0.01。

表3 干預(yù)14 d 脛骨骨痂Micro-CT（±s）

表3 干預(yù)14 d 脛骨骨痂Micro-CT（±s）

注：與生理鹽水組比較，?P＜0.05。

表4 干預(yù)28 d 脛骨骨痂Micro-CT（±s）

表4 干預(yù)28 d 脛骨骨痂Micro-CT（±s）

注：與生理鹽水組比較，?P＜0.05。

表5 干預(yù)28 d 脛骨骨折部位生物力學(xué)（±s）

表5 干預(yù)28 d 脛骨骨折部位生物力學(xué)（±s）

注：與生理鹽水組比較，?P＜0.05。

圖3 干預(yù)7、14、28 d 脛骨骨折部位HE 染色

3.3.2 ABHO 染色 強(qiáng)骨膠囊組7 d 時(shí)骨折部位可見大量軟骨細(xì)胞增殖，細(xì)胞活性明顯優(yōu)于生理鹽水組；14 d 時(shí)，強(qiáng)骨膠囊組骨痂中軟骨細(xì)胞逐漸凋亡，而成骨細(xì)胞不斷增加；28 d 時(shí)，強(qiáng)骨膠囊組成骨細(xì)胞在殘留的鈣化軟骨基質(zhì)上形成新的骨組織，使斷端愈合、連續(xù)，骨髓腔再通，而生理鹽水組骨痂中仍有較多骨小梁存在，排列雜亂，見圖4。

圖4 干預(yù)7、14、28 d 脛骨骨折部位ABHO 染色

4 討論

女性月經(jīng)終止后，卵巢雌激素分泌減少是導(dǎo)致其早期骨質(zhì)流失的根本原因，導(dǎo)致骨保護(hù)作用及維生素D 活性降低［5］，5～10 年骨量年丟失率約3%～5%；由于骨吸收大于骨形成，骨小梁連續(xù)性中斷，皮質(zhì)骨變薄且多孔，從而易誘發(fā)骨質(zhì)疏松性骨折［6］。

骨質(zhì)疏松性骨折的愈合過程通常包括纖維、軟骨及骨性骨痂期［7］。骨痂的形成機(jī)制對(duì)臨床骨折愈合至關(guān)重要，反映了骨組織再生修復(fù)的自然規(guī)律［8］，軟骨痂具有較大的黏彈性，是骨痂調(diào)控的黃金階段，內(nèi)含大量成骨干細(xì)胞及成骨因子，研究認(rèn)為軟骨內(nèi)成骨遲緩、骨折愈合質(zhì)量低下是骨質(zhì)疏松性骨折愈合的重要特征［9］。本實(shí)驗(yàn)中影像學(xué)結(jié)果可見生理鹽水組骨痂的形成、發(fā)展及骨折線的消失明顯滯后于強(qiáng)骨膠囊組；病理學(xué)染色顯示生理鹽水組小鼠7 d時(shí)骨折斷端附近軟骨細(xì)胞數(shù)目稀少，軟骨痂形成不足；14 d時(shí)生理鹽水組骨痂內(nèi)小梁稀疏，軟骨細(xì)胞較少，強(qiáng)骨膠囊組軟骨細(xì)胞逐漸凋亡，成骨細(xì)胞增加，且小梁致密；28 d 時(shí)生理鹽水組骨髓腔未再通，仍有部分骨痂存在，且內(nèi)部骨小梁排列紊亂，而強(qiáng)骨膠囊組骨髓腔再通，皮質(zhì)連續(xù)。

進(jìn)一步通過Micro-CT 定量分析，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)骨膠囊可顯著提高早中期骨痂形成的體積、骨小梁連接密度及骨痂密度；后期2 組差異不明顯，認(rèn)為可能由于強(qiáng)骨膠囊組在14～28 d期間，硬骨痂吸收、重塑，骨折斷端已愈合，而生理鹽水組28 d 時(shí)斷端周圍仍有部分硬骨痂存在，導(dǎo)致Micro-CT 定量分析2 組差異不明顯。而有限元分析提示強(qiáng)骨膠囊能夠明顯增加骨折后期（28 d）愈合部位的剛度和彈性模量，最大受力強(qiáng)度也有所提高，促進(jìn)其生物力學(xué)性能的恢復(fù)。

骨質(zhì)疏松性骨折多歸類于《黃帝內(nèi)經(jīng)》 中“骨痹”“骨痿”等范疇［10］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎主骨，生髓藏精”，更年期階段女性“天癸絕”，腎精逐漸衰少、骨髓生化乏源，骨骼失以充養(yǎng)而導(dǎo)致骨痿［11］。《內(nèi)經(jīng)》 記載：“骨痿者，補(bǔ)腎法治之”的論述，因此，補(bǔ)腎法是中醫(yī)治療PMOP 的基本大法。對(duì)“腎-骨-骨髓”間生理關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎中藥能夠促進(jìn)骨髓間充干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)骨的生長(zhǎng)和修復(fù)［12］。骨碎補(bǔ)具有補(bǔ)腎、續(xù)傷、壯骨等功效，其提取物骨碎補(bǔ)總黃酮，作為強(qiáng)骨膠囊的主要成分［13］，被廣泛用于骨質(zhì)疏松［14］、脆性骨折、肢體關(guān)節(jié)及腰背疼痛等治療［15］。研究［16］表明骨碎補(bǔ)能夠促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收增加骨密度，其作用機(jī)制可能包括促進(jìn)OPG 在成骨細(xì)胞中的表達(dá)，下調(diào)RANKL 和RANK 表達(dá)，并抑制破骨細(xì)胞活性［17-18］；促使去勢(shì)后血清破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞分化刺激因子減少，如白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，而升高白細(xì)胞介素4（IL-4）等［19］；降低血漿黏度，改善骨折斷端部位的血運(yùn)，增加BMP-2 及IGF-1 水平，促進(jìn)軟骨、成骨細(xì)胞的增殖分化［20］；減輕血清瘦素（LEP）對(duì)骨組織受體β2-腎上腺素受體（ADRB2）的激活效果，從而下調(diào)去勢(shì)后大鼠IL-6 和前列腺素E2（PGE2）的表達(dá)，抑制骨吸收［21］；下調(diào)血清組織蛋白酶K mRNA 的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，增加骨強(qiáng)度［22］；提高骨髓腔中成骨細(xì)胞的代謝型谷氨酸（GLU）受體-5 的表達(dá)，調(diào)節(jié)骨組織細(xì)胞的生理活性和分化成熟等細(xì)胞進(jìn)程［23］；上調(diào)核結(jié)合因子a1（cbfa1）表達(dá)的水平，促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化［24］。

本實(shí)驗(yàn)僅從影像學(xué)和病理組織學(xué)分析了強(qiáng)骨膠囊促進(jìn)去勢(shì)后小鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合的功能，尚需對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)一步深入研究。