補(bǔ)腎中藥對(duì)老齡小鼠骨髓脂質(zhì)過(guò)氧化與氧化應(yīng)激損傷的影響

王翰宇黃啟明羅 斌蔡俊笙程志安?

［1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬襄陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院骨科，湖北 襄陽(yáng) 441000；2.怡諾博（北京） 生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，北京 100088；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院／廣東省中醫(yī)院二沙島醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510105］

隨著年齡增大，由于脂質(zhì)代謝異常和骨髓成骨能力下降造成的骨質(zhì)疏松成為困擾老年人的常見(jiàn)疾病，特別是絕經(jīng)后婦女雌激素水平下降，導(dǎo)致骨生成和骨吸收的代謝失衡［1］。在老化過(guò)程中，脂質(zhì)過(guò)氧化在骨骼中的水平顯著增高，脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中，脂氧酶（如Alox15）與多不飽和脂肪酸形成的產(chǎn)物結(jié)合并激活過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體，形成4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE），增加骨組織活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生［2］。一旦4-HNE 積累達(dá)到一定濃度，將對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性、基因誘變性以及致癌作用［3］。

近年來(lái)應(yīng)用干細(xì)胞在臨床上治療骨科疾病、心腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面的研究已取得較大進(jìn)展［4-6］。干細(xì)胞良好的成骨和成脂分化潛能，以及分泌細(xì)胞因子與外泌體是其移植修復(fù)組織缺損成功的關(guān)鍵，如骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞等，但其在脂質(zhì)過(guò)氧化及其引起對(duì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷還未研究過(guò)。

C57BL／6（B6）小鼠在3～6 個(gè)月齡為成熟成年，在10～14 個(gè)月齡為中年，在18～24 個(gè)月齡為老齡［7］。本研究分別取不同月齡的小鼠，擬通過(guò)脂肪干細(xì)胞（adiposederived stem cells，ADSCs）對(duì)其骨髓脂質(zhì)過(guò)氧化及其氧化應(yīng)激損傷的影響，并以補(bǔ)腎中藥作為對(duì)照，分析其對(duì)老齡小鼠骨髓細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物4-HNE、氧應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的自由基ROS 及凋亡水平進(jìn)行檢測(cè)，為臨床老齡骨質(zhì)疏松患者組織缺損的修復(fù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 6、10、15、19 月個(gè)齡雌性C57BL／6（B6）小鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供與飼養(yǎng)，使用許可證號(hào)SYXK（粵）2013-0094，并通過(guò)廣東省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的審查，編號(hào)為2017035。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度控制在（22±3）℃，相對(duì)濕度為（50±20）%，燈光每天控制12 h 開(kāi)燈／12 h 黑暗循環(huán)。動(dòng)物飼料符合動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。飲水不限制。

1.2 藥物與試劑 金匱腎氣丸由干地黃、山藥、山萸肉、澤瀉、茯苓、牡丹皮、桂枝、附子按8∶4∶4∶4∶3∶3∶1∶1比例組成；健骨二仙丸由龜版、鹿角膠、黨參、枸杞子、續(xù)斷、山藥按1∶1∶3∶3∶6∶6 比例組成，以上飲片均購(gòu)自廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部，并經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院黃永明主任醫(yī)師鑒定為正品，符合《中國(guó)藥典》規(guī)范，常規(guī)法水煎各方藥，濃縮水煎液后進(jìn)行小鼠灌胃給藥。α-MEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)12571063）；青霉素與鏈霉素（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)10378016）；淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號(hào)20180902）；胎牛血清（美國(guó) Gibco 公司，批號(hào)1992275）；CD90-FITC（美國(guó) Biolegend 公司，批號(hào)328107）；CD105-PE（美國(guó)Biolegend 公司，批號(hào)323205）；CD73-FITC（美國(guó)Biolegend 公司，批號(hào)344015）；CD44-PE（美國(guó)Biolegend 公司，批號(hào)338807）；CD34-PerCP（美國(guó)Biolegend 公司，批號(hào) 343519）；CD29-PerCP（美國(guó)Biolegend 公司，批號(hào)303023）；CD45-APC（美國(guó)Biolegend公司，批號(hào)304011）；HLA-DR-APC（美國(guó)Biolegend 公司，批號(hào)307609）；4-HNE ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)E-EL-H2340c）；活性氧檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)S0033）；Annexin V-FITC 凋亡試劑盒（日本同仁化學(xué)，貨號(hào)AD10）。

1.3 儀器 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司）；熒光酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；離心機(jī)（美國(guó)Sigma 公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)與表型分析 采取健康正常人大腿脂肪20 mL（與其簽署知情同意書(shū)，承諾用于科研），用1 倍體積的1×PBS（pH 7.4）洗滌3 次，去除油脂后加入0.2%膠原酶I 消化4 h，振蕩30 min／次，加入1 倍體積的1×PBS洗滌2 次，獲得的細(xì)胞沉淀用含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)液接種于塑料材質(zhì)的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。48 h 后換液去除未貼壁細(xì)胞，以后每3 d 換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)消化、傳代。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型，誘導(dǎo)成骨和成脂分化鑒定脂肪干細(xì)胞。

取1.5×106個(gè)第5 代脂肪干細(xì)胞，分3 組進(jìn)行染色，第1 組為CD90-FITC、CD44-PE、CD34-PerCP 和CD45-APC，第2 組為CD73-FITC、CD105-PE、CD29-PerCP 和HLA-DR-APC，第3 組同型對(duì)照為IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP 和IgG1-APC，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞表型。

2.2 脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨和成脂分化 取1.0×104／mL 第5 代脂肪干細(xì)胞接種于6 孔板中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2 d，將細(xì)胞換成完全成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3～4 d換液，培養(yǎng)21 d，將細(xì)胞固定進(jìn)行茜素紅染色鑒定。

取1.0×104／mL 第5 代脂肪干細(xì)胞接種于6 孔板中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2 d，將細(xì)胞換成完全成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3～4 d 換液，進(jìn)行培養(yǎng)14 d，將細(xì)胞固定進(jìn)行油紅O 染色鑒定。

2.3 雌性C57BL／6（B6）小鼠實(shí)驗(yàn)分組 將6、10、15、19 個(gè)月齡雌性C57BL／6（B6）小鼠隨機(jī)分為健骨二仙丸組（5 只）、金匱腎氣丸組（5 只）、脂肪干細(xì)胞組（5 只）與正常對(duì)照組（3 只）。健骨二仙丸組小鼠按照體質(zhì)量進(jìn)行給藥，給藥量為10 mL／kg，灌胃給藥，1 次／d，生藥濃度為3.45 g／mL，連續(xù)4 周；金匱腎氣丸組小鼠按照體質(zhì)量進(jìn)行給藥，給藥量為15 mL／kg，灌胃給藥，1 次／d，濃度為0.84 生藥g／mL，連續(xù)4 周；脂肪干細(xì)胞小鼠移植量細(xì)胞1×106／kg，0.2 mL 尾靜脈注射，1 次／周，共4 次；正常對(duì)照組小鼠灌胃，1 次／d，共4 周。

2.4 ELISA 法測(cè)定4-HNE 水平 取新鮮的骨髓細(xì)胞懸液（1×106／mL），加入1.4 mmol／L 含蛋白酶抑制劑的2-巰基乙醇混合物，在液氮和室溫中反復(fù)凍融3～5 次，離心，確定可溶解性蛋白。離心后上清液加入96 孔板中，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD，計(jì)算小鼠4-HNE 水平。

2.5 檢測(cè)骨髓細(xì)胞內(nèi)ROS 水平 取新鮮分離的骨髓細(xì)胞（2×106／mL）用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2 次，將細(xì)胞分別重懸于10 μmol／L DCFH-DA 中，37 ℃避光孵育60 min，每3～5 min 顛倒混勻一下，使細(xì)胞和探針充分接觸；無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次以充分去除未結(jié)合的探針，重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以未裝載熒光探針的正常細(xì)胞作為對(duì)照。將染色后的細(xì)胞重懸后，取100 μL 細(xì)胞懸液加到96 孔板中，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，計(jì)算出ROS 的相對(duì)量。

2.6 流式細(xì)胞儀法檢測(cè)骨髓細(xì)胞凋亡 取新鮮分離的骨髓細(xì)胞（0.5×106／mL）用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2 次，加入1×PBS（pH 7.4）重懸，進(jìn)行Annexin V-FITC 和PI 進(jìn)行染色，4 ℃冰箱孵育30 min 后，用1×PBS 洗滌2 次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 脂肪干細(xì)胞表型鑒定 脂肪干細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后呈梭性上皮樣生長(zhǎng)，傳代培養(yǎng)到第5 代鑒定細(xì)胞表型。其表達(dá)的CD90 為99.92%，CD44 為99.39%，CD73 為99.11%，CD105 為99.12%（圖1），CD34、CD29、CD45 和HLA-DR均小于2%以下，表明培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞表型特征。

3.2 脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨和成脂分化 脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)14 d 后，細(xì)胞表面出現(xiàn)沉積鈣鹽，形成鈣結(jié)節(jié)，經(jīng)茜素紅染色后呈橘紅色鈣結(jié)節(jié)，表明脂肪干細(xì)胞可以誘導(dǎo)成骨分化。脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d 后，累積脂質(zhì)，脂滴變大并合并呈串珠狀，經(jīng)油紅O 染色呈鮮紅色，表明脂肪干細(xì)胞可以誘導(dǎo)成脂分化。見(jiàn)圖2。

圖2 脂肪干細(xì)胞分化潛能染色（×10）

3.3 骨髓細(xì)胞4-HNE 水平 隨著小鼠月齡增大，正常對(duì)照組4-HNE 水平呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，而脂肪干細(xì)胞組呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與正常對(duì)照組比較，脂肪干細(xì)胞組10、15、19個(gè)月齡小鼠4-HNE 水平下降（P＜0.01）；與脂肪干細(xì)胞組比較，健骨二仙丸組、金匱腎氣丸組4-HNE 水平上升（P＜0.05，P＜0.01），與正常對(duì)照組比較，健骨二仙丸組、金匱腎氣丸組和脂肪干細(xì)胞組19 個(gè)月齡老年小鼠骨髓細(xì)胞。4-HNE 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖3、表1。

3.4 骨髓細(xì)胞ROS 水平 細(xì)胞流式結(jié)果顯示，正常對(duì)照組中隨著小鼠月齡逐漸增大，ROS 水平從17.73% 上升到53.92%；健骨二仙丸灌胃組中隨著小鼠月齡逐漸增大，ROS 水平從7.57%上升到32.69%；金匱腎氣丸灌胃組中隨著小鼠月齡逐漸增大，ROS 水平從5.88%上升到32.20%；脂肪干細(xì)胞移植組中隨著小鼠月齡逐漸增大，ROS 水平從6.80%上升到24.04%，見(jiàn)圖4～7。

圖3 各組不同月齡小鼠4-HNE 水平

表1 各組19 個(gè)月齡老年小鼠骨髓細(xì)胞4-HNE、ROS 水平（±s，n＝5）

表1 各組19 個(gè)月齡老年小鼠骨髓細(xì)胞4-HNE、ROS 水平（±s，n＝5）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

圖4 正常對(duì)照組在不同月齡小鼠中骨髓細(xì)胞ROS 流式細(xì)胞圖

圖5 健骨二仙丸灌胃后在不同月齡小鼠中ROS 流式細(xì)胞圖

圖6 金匱腎氣丸灌胃后在不同月齡小鼠中ROS 流式細(xì)胞圖

圖7 脂肪干細(xì)胞組在不同月齡小鼠中ROS 流式細(xì)胞圖

與正常對(duì)照組比較，脂肪干細(xì)胞組10、15、19 個(gè)月齡小鼠骨組織中ROS 水平降低（P＜0.05）；與脂肪干細(xì)胞組比較，健骨二仙丸組和金匱腎氣丸組ROS 水平上升（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖8。其中，19 月齡老年小鼠骨髓細(xì)胞，與正常對(duì)照組相比，金匱腎氣丸組ROS 水平下降（P＜0.01），見(jiàn)表1。

圖8 各組小鼠ROS 熒光酶標(biāo)儀熒光強(qiáng)度

3.5 骨髓細(xì)胞凋亡 健骨二仙丸、金匱腎氣丸與脂肪干細(xì)胞移植均抑制了骨髓細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖9～12。與正常對(duì)照組比較，健骨二仙丸組、金匱腎氣丸組、脂肪干細(xì)胞組在不同月齡小鼠骨髓細(xì)胞凋亡率均下降（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同月齡小鼠中骨髓細(xì)胞凋亡率（%，±s，n＝5）

表2 不同月齡小鼠中骨髓細(xì)胞凋亡率（%，±s，n＝5）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05。

4 討論

人口老齡化加速導(dǎo)致我國(guó)骨質(zhì)疏松及骨折發(fā)病率逐年上升，老化不僅使機(jī)體整體內(nèi)環(huán)境發(fā)生巨大改變，也使骨髓內(nèi)微環(huán)境與復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)調(diào)控發(fā)生變化。機(jī)體衰老造成內(nèi)環(huán)境氧化應(yīng)激水平逐漸增高，抗氧化應(yīng)急能力降低，導(dǎo)致骨質(zhì)量下降，骨皮質(zhì)變薄，骨髓脂肪組織增多［8］。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激（如輻射、缺血、缺氧等）時(shí)，體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多，不能有效及時(shí)地被抗氧化系統(tǒng)清除，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷［9］。氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的自由基包括ROS，如活性成分攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，會(huì)產(chǎn)生一系列復(fù)雜產(chǎn)物和新的自由基，4-HNE 即為脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中最具代表性的醛基產(chǎn)物［10］。

4-HNE 是一種含氧αβ 不飽和醛，來(lái)源于ω-6 多不飽和脂肪酸（如亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸）的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，是此過(guò)程中產(chǎn)生的最主要的一種醛類(lèi)。正常情況下，4-HNE 在機(jī)體的細(xì)胞或組織內(nèi)維持在極低的生理濃度，當(dāng)機(jī)體受到刺激發(fā)生氧化應(yīng)激后水平顯著增高，在肝細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、心臟和小腸等組織中得到證實(shí)［11］，此外，研究發(fā)現(xiàn)人體血漿中4-HNE 水平隨年齡增長(zhǎng)而逐漸升高，且輕度認(rèn)知障礙患者大腦組織中的其水平較同齡健康人顯著增多［12］，但有關(guān)骨髓中其作用機(jī)制研究還甚少。本研究通過(guò)不同月齡小鼠，包括成熟成年、中年和老年，研究其4-HNE 水平對(duì)ROS 水平的影響，以及所引起的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，以探究脂肪干細(xì)胞移植和補(bǔ)腎中藥灌胃對(duì)這一過(guò)程的改善作用，抑制4-HNE誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化以及ROS 激發(fā)的氧化應(yīng)激損傷。

圖9 正常對(duì)照組在不同月齡小鼠中骨髓細(xì)胞凋亡流式圖

圖10 健骨二仙丸組在不同月齡小鼠中骨髓細(xì)胞凋亡流式圖

圖11 金匱腎氣丸組在不同月齡小鼠中骨髓細(xì)胞凋亡流式圖

圖12 脂肪干細(xì)胞移植組在不同月齡小鼠中骨髓細(xì)胞凋亡流式圖

實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)獲得第5 代脂肪干細(xì)胞，具有符合標(biāo)準(zhǔn)要求的細(xì)胞表型和成骨與成脂分化能力。19 個(gè)月齡小鼠中，與正常對(duì)照組比較，健骨二仙丸組、金匱腎氣丸組、脂肪干細(xì)胞組抑制4-HNE、ROS 水平（P＜0.05，P＜0.01）；在不同月齡小鼠中，與正常對(duì)照組比較，健骨二仙丸組、金匱腎氣丸組、脂肪干細(xì)胞組抑制骨髓細(xì)胞凋亡率（P＜0.05）。

骨髓內(nèi)微環(huán)境改變使具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）功能發(fā)生改變，細(xì)胞形態(tài)改變、增殖與分化潛能減退、老化細(xì)胞增多、端粒長(zhǎng)度變短、端粒酶活性降低、以及成骨活性喪失等［13］。就成骨與成脂肪潛能而言，老化使MSCs 更趨向于分化為脂肪細(xì)胞而不是成骨細(xì)胞。隨著年齡的增加，MSCs 分化為成骨細(xì)胞數(shù)量的減少和成骨能力的減弱，骨量持續(xù)性地減少和丟失，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松及其骨折［14］。與老化相關(guān)的MSCs 增殖活性，分化能力、成骨以及成脂肪分化潛能和方向的改變，一方面涉及老化所致的細(xì)胞自身內(nèi)在因素改變，另一方面涉及細(xì)胞外骨髓內(nèi)微環(huán)境的改變。

補(bǔ)腎中藥能促進(jìn)MSCs 成骨細(xì)胞分化并增加其成骨活性，調(diào)控成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，雖然不能誘導(dǎo)MSCs 的成骨細(xì)胞分化，但對(duì)MSCs 定向成骨細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用，并能提高其分化后的成骨活性［15］。結(jié)合氧化應(yīng)激與老化的關(guān)系，補(bǔ)腎中藥可提高抗氧化應(yīng)激能力與抑制MSCs 衰老，從而控制老化所導(dǎo)致的骨髓脂質(zhì)氧化和氧化應(yīng)急。

本研究結(jié)果表明，針對(duì)老齡小鼠，補(bǔ)腎中藥灌胃和脂肪干細(xì)胞移植均可以抑制骨髓細(xì)胞4-HNE 水平，抑制ROS水平；從而抑制老齡小鼠骨髓細(xì)胞凋亡率，且脂肪干細(xì)胞移植對(duì)骨髓脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激損傷作用更為顯著。