甘草黃酮聯(lián)合順鉑對(duì)Lewis 肺癌荷瘤小鼠的影響

陳巖巖，周淑娟，夏玉朝，薛曉拉，楊少杰，胡彥輝

（1.鄭州市第六人民醫(yī)院，河南 鄭州 450015；2.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

肺癌作為我國臨床高發(fā)癌種，發(fā)病率和死亡率占全部惡性腫瘤的20%～25%，預(yù)計(jì)五年內(nèi)我國肺癌患病人數(shù)可上百萬［1-2］。目前針對(duì)肺癌患者的治療主要以西醫(yī)手術(shù)、放化療加藥物干預(yù)為主，因病程漫長、不良反應(yīng)大，患者生存期呈現(xiàn)明顯縮短［3］。隨著中醫(yī)藥在化療減毒增效方面的不斷研究，中藥活性成分與西藥化療藥聯(lián)合的抗癌療法已被廣泛應(yīng)用，在抗癌方面發(fā)揮著增效減毒的良好有優(yōu)勢［4］。甘草黃酮為甘草中藥活性成分之一，研究［5-6］表明有較好的抗腫瘤作用，對(duì)多種癌種有效。本文選取甘草黃酮與順鉑聯(lián)合使用，觀察其對(duì)Lewis 肺癌荷瘤小鼠的藥效學(xué)研究。

1 材料

1.1 試劑與藥物 甘草黃酮（西安森冉生物工程有限公司，純度為54.2%，批號(hào)20170618）。順鉑（DDP，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)20170413）。血清白介素-2（IL-2）ELISA 試劑盒（批號(hào)E20170805A）、白介素-10（IL-10）ELISA 試劑盒（批號(hào)E20170812A）、腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA 試劑盒（批號(hào)E20170724A）、干擾素-γ（TFN-γ）ELISA 試劑盒（批號(hào)E20170716A）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）ELISA 試劑盒（批號(hào)E20170809A）、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）ELISA 試劑盒（批號(hào)E20170716A）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）ELISA 試劑盒（批號(hào)E20170624A）均購于蘇州卡爾文生物科技有限公司。

1.2 瘤株及動(dòng)物 Lewis 肺癌細(xì)胞（Lewis lung cancer cell，LLC），上海斯信生物科技有限公司。SPF 級(jí)6～8 周齡C57BL／6 J 小鼠80 只，雌雄各半，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（魯）2014-0007。

1.3 儀器 H3018DR 高速冷凍離心機(jī)（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司）；CS-6400 全自動(dòng)生化分析儀（迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌細(xì)胞于10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下隔天換液，進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，胰蛋白酶進(jìn)行消化，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 造模、分組及給藥 造模及給藥參考文獻(xiàn)［7-8］。選取狀態(tài)良好的小鼠60 只，隨機(jī)分為空白組、模型組、順鉑組、甘草黃酮組、低聯(lián)合組（低劑量甘草黃酮+順鉑）、高聯(lián)合組（高劑量甘草黃酮+順鉑），每組10 只，空白組除外，其余各組小鼠于右腋皮下接種LLC 細(xì)胞懸液，每只0.2 mL（細(xì)胞計(jì)數(shù)器選取活細(xì)胞數(shù)＞95%，細(xì)胞濃度為1×107／mL），接種細(xì)胞7 d 后，造模小鼠右腋下均形成瘤塊。順鉑組小鼠腹腔注射順鉑（6 mg／kg），1 次／周，給藥3 周；甘草黃酮組小鼠灌胃甘草黃酮（200 mg／kg），灌胃體積為0.2 mL／100 g，1 次／d，連續(xù)3 周；低、高聯(lián)合組小鼠在腹腔注射順鉑（6 mg／kg），1 次／周，給藥3 周的基礎(chǔ)上，灌胃給藥甘草黃酮（200、400 mg／kg），1 次／d，連續(xù)3 周；空白組、模型組小鼠給予0.5% CMC-Na 灌胃給藥。

2.3 ELISA 檢測 各組小鼠于末次給藥2 h 后，腹主動(dòng)脈取血，離心后取上清液，檢測血清中IL-2、IL-10、TNF-α、TFN-γ、VEGF、HIF-1α、MMP-2 水平。

2.4 腫瘤抑制率檢測 各組小鼠于末次給藥2 h 后剪下瘤塊，稱定質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑制率［（1-給藥組平均瘤重／模型組平均瘤重）×100%］。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 對(duì)Lewis 肺癌小鼠腫瘤抑制率的影響（±s，n＝10）

表1 對(duì)Lewis 肺癌小鼠腫瘤抑制率的影響（±s，n＝10）

注：與模型組比較，?P＜0.05；與順鉑組比較，#P＜0.05。

3 結(jié)果

3.1 甘草黃酮聯(lián)合順鉑對(duì)Lewis 肺癌小鼠腫瘤抑制率的影響 由表1 可知，與模型組比較，順鉑組、甘草黃酮組及高、低聯(lián)合組瘤重降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，甘草黃酮組瘤重增加，高、低聯(lián)合組瘤重降低（P＜0.05）。

3.2 甘草黃酮聯(lián)合順鉑對(duì)Lewis 肺癌小鼠血清炎癥因子水平的影響 由表2 可知，模型組血清IL-2、TFN-γ、TNF-α水平均較空白組降低，IL-10 水平較空白組升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組血清IL-2、TFN-γ、TNF-α 水平升高，血清IL-10 水平降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，甘草黃酮組血清IL-2 水平降低，血清IL-10 水平升高（P＜0.05），高、低聯(lián)合組血清IL-2、TFN-γ、TNF-α 水平升高，血清IL-10 水平降低（P＜0.05）。

表2 對(duì)Lewis 肺癌小鼠血清炎癥因子水平的影響（±s，n＝10）

表2 對(duì)Lewis 肺癌小鼠血清炎癥因子水平的影響（±s，n＝10）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，?P＜0.05；與順鉑組比較，#P＜0.05。

3.3 甘草黃酮聯(lián)合順鉑對(duì)Lewis 肺癌小鼠血清VEGF、HIF-1α、MMP-2 水平的影響 由表3 可知，模型組血清VEGF、HIF-1α、MMP-2 水平均較空白組升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組血清VEGF、HIF-1α、MMP-2 水平降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，甘草黃酮組血清VEGF、HIF-1α、MMP-2 水平升高（P＜0.05），高、低聯(lián)合組血清VEGF、HIF-1α、MMP-2 水平降低（P＜0.05）。

表3 對(duì)Lewis 肺癌小鼠血清VEGF、HIF-1α、MMP-2 水平的影響（±s，n＝10）

表3 對(duì)Lewis 肺癌小鼠血清VEGF、HIF-1α、MMP-2 水平的影響（±s，n＝10）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，?P＜0.05；與順鉑組比較，#P＜0.05。

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為肺癌是一種全身屬虛，局部屬實(shí)的疾病，發(fā)病因素多與正氣虧虛，邪氣入侵有關(guān)，多數(shù)臨床患者接受放化療藥物（熱毒）治療，出現(xiàn)津液耗傷，最終形成氣陰兩虛證，導(dǎo)致患者免疫力明顯低下。肺癌可累及諸多臟器，而脾臟和腎臟將是最先涉及的臟器［9-10］。近年來，具有健脾補(bǔ)腎益氣養(yǎng)陰類功效的中藥被研究者廣泛用于肺癌疾病的治療，中藥在治療肺癌疾病方面可發(fā)揮顯著療效，其抗癌機(jī)制主要通過增強(qiáng)免疫功能、調(diào)控細(xì)胞周期及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抗血管生成及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的途徑發(fā)揮療效，達(dá)到提高患者生活質(zhì)量、緩解病痛、延長生存期限、穩(wěn)定腫瘤病灶的目的［11-12］。黃酮類化合物作為重要活性成分，在抗腫瘤方面發(fā)揮著良好作用。甘草黃酮是甘草中重要的活性成分，研究［13-14］發(fā)現(xiàn)甘草中的黃酮類成分對(duì)臨床常見癌種可發(fā)揮良好的抗癌效果，如甘草中的查爾酮A 可有效調(diào)控人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與凋亡；甘草黃酮可有效抑制肝癌Bel-7402 細(xì)胞的增長等。本研究選取甘草黃酮聯(lián)合順鉑探討其對(duì)肺癌動(dòng)物模型的藥效學(xué)研究。

肺癌患者在受到癌細(xì)胞侵襲時(shí)，機(jī)體免疫反應(yīng)被激活，發(fā)揮免疫抵抗作用。IL-2 作為免疫增強(qiáng)劑，在機(jī)體受到癌細(xì)胞侵襲時(shí)會(huì)大量分泌增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)。作為免疫反應(yīng)的參與者，IFN-γ 可促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖、分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺滅，此外，IFN-γ 可通過血管內(nèi)皮生長因子VEGF基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抑制腫瘤血管生長的作用［15］。TNF-α 可通過炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答作用使血管豐富的腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的壞死和生長抑制，發(fā)揮抗腫瘤作用。IL-10在癌細(xì)胞入侵時(shí)，可抑制NK 細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺滅，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，同時(shí)IL-10 可增強(qiáng)引流淋巴管腫瘤的數(shù)量和抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。HIF-1α 作為需氧型轉(zhuǎn)錄因子，缺氧環(huán)境下，在癌細(xì)胞中的表達(dá)數(shù)量增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管生成及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［7］。VEGF 作為目前癌癥研究的重要靶點(diǎn)，在人體正常組織中并無表達(dá)，當(dāng)機(jī)體遭受癌細(xì)胞侵襲時(shí)，VEGF 在癌細(xì)胞中數(shù)量急劇增加，通過新血管生成促進(jìn)癌細(xì)胞增殖分化及轉(zhuǎn)移［16-17］。MMP-2 是MMPs 家族中的一種，研究發(fā)現(xiàn)其在肺癌組織中的水平較高，可降解基質(zhì)、膠原蛋白，突破基質(zhì)屏障，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌動(dòng)物模型血清IL-10、VEGF、HIF-1α、MMP-2 水平均明顯高于空白組，IL-2、TFN-γ、TNF-α 水平均較空白組降低，顯示模型復(fù)制成功。與模型組相比，高、低聯(lián)合組可有效降低血清IL-10、VEGF、HIF-1α、MMP-2 水平，升高IL-2、TFN-γ、TNF-α 水平，并能很好控制瘤體的增長，甘草黃酮組也可顯著改善以上指標(biāo)，但在降低模型動(dòng)物血清IL-10、VEGF、HIF-1α、MMP-2 水平，升高IL-2 水平方面療效不及順鉑組。

本次研究可知甘草黃酮與順鉑聯(lián)合使用可有效抑制肺癌動(dòng)物腫重的增加，升高模型動(dòng)物血清IL-2、TFN-γ、TNF-α 水平，降低血清IL-10、VEGF、HIF-1α、MMP-2 水平，減少化療藥順鉑帶來的免疫低下的副作用，從而提高肺癌動(dòng)物機(jī)體免疫能力，抑制腫瘤組織血管生成，達(dá)到良好的抗癌作用。