復(fù)方七芍降壓片對SHR 大鼠IL-8、IL-10 水平及AP-1、MCP-1 蛋白表達(dá)的影響

任衛(wèi)瓊李 弘劉葉倩龔 姍劉 林王宇紅?

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

近10 年，我國成年人中約有30%患有高血壓，其中一部分伴隨著冠狀動(dòng)脈疾病、中風(fēng)和心力衰竭等的發(fā)生［1-2］，高血壓是導(dǎo)致人類死亡的重大疾病之一，我國患者以原發(fā)性高血壓為主，其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，是在炎癥、神經(jīng)-免疫因素等多種因素的相互作用下導(dǎo)致的［3］。近年來，炎癥與高血壓的相關(guān)性已成為研究的熱點(diǎn)，國內(nèi)外文獻(xiàn)均報(bào)道炎癥與高血壓的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)［4］，文獻(xiàn)［5-6］報(bào)道通過調(diào)控激活子蛋白-1（AP-1）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1），會影響炎癥因子的釋放。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方七芍降壓片對高血壓患者具有較好的治療作用，其機(jī)制與改善炎癥有關(guān)，但該方是否通過AP-1、MCP-1 通路影響炎癥因子的釋放發(fā)揮調(diào)控血壓的作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)方七芍降壓片干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR），觀察其對SHR 的降壓作用及對炎癥因子白細(xì)胞介素-8（IL-8）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）水平和AP-1、MCP-1 蛋白表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級、6～7 周齡雄性SHR 大鼠30 只，體質(zhì)量130～150 g；6～7 周齡雄性WKY 大鼠10 只，體質(zhì)量130～150 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號11400700359571，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證號SYXK（湘）2015-0003。

1.2 試劑與藥物 復(fù)方七芍降壓片（0.46 g／片，批號20181026），人臨床用量為12 片，相當(dāng)于含生藥量97 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科制備；厄貝沙坦片（75 mg／片，批號17122111），人臨床用量為300 mg／d，購自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司；IL-8、IL-10 檢測試劑盒（批號20190305，上海晶天生物科技有限公司）；c-jun（批號AI03113818）、MCP-1（批號AB05105689）一抗購自美國Bioss 公司。

1.3 儀器 AUW2200 型分析天平（日本島津公司）；BP2010 型無創(chuàng)血壓檢測儀（北京軟隆科技有限公司）；H1850 型低速臺式離心機(jī)（湖南湘儀儀器有限公司）；BMJ-1n 型病理組織包埋機(jī)、包埋冷凍臺（上海珂淮儀器有限公司）；TS-12F 型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（上海華巖儀器設(shè)備有限公司）；UC-7 超薄切片機(jī)（北京冠普佳科技有限公司）；日立HT7700 透射電鏡（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；OLYMPU 倒置顯微鏡和照相裝置（日本Olympus 公司）；KS400 型圖像分析儀（德國Zisse 公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 30 只SHR 大鼠根據(jù)體質(zhì)量、血壓，隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦片組、復(fù)方七芍降壓片組，每組10 只；另設(shè)10 只WKY 大鼠為正常對照組。正常對照組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水，厄貝沙坦片組大鼠給予厄貝沙坦片混懸液（27 mg／kg），復(fù)方七芍降壓片組大鼠給予復(fù)方七芍降壓片藥液［8.73 g／kg（生藥）］，給藥體積為10 mL／kg，灌胃給藥1 次／d，連續(xù)給藥6 周，每周測量1次血壓和體質(zhì)量。

2.2 血壓測定 分別在給藥前及給藥第1、2、3、4、5、6周早上8：00～12：00，采用無創(chuàng)血壓儀測量大鼠給藥后1 h尾動(dòng)脈壓，每只測量3 次，取平均值。

2.3 透射電鏡觀察腸系膜動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu) 取腸系膜上動(dòng)脈（二級分支）于2.5%戊二醛中固定，4 ℃過夜，1%鋨酸固定液固定1～2 h，丙酮梯度脫水、浸泡、包埋，37 ℃烘烤過夜固定，切超薄片（50～100 nm），3% 醋酸鈾、硝酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察并拍照。

2.4 ELISA 法檢測血清中IL-8、IL-10 水平 在末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后采取腹主動(dòng)脈血于血清管中（不抗凝），靜置2 h，離心（4 500 r／min）10 min，取上清于1.5 mL 離心管中，貯存于-80 ℃冰箱。嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作步驟，測定血清中IL-8、IL-10水平。

2.5 免疫組化檢測AP-1、MCP-1 蛋白表達(dá) 取腸系膜上動(dòng)脈（二級分支），生理鹽水清洗干凈，4%多聚甲醛固定，浸蠟包埋，切厚度為5 μm 的切片，二甲苯脫蠟，酒精逐級脫水，一抗孵育4 ℃過夜，二抗孵育，DAB 顯色，復(fù)染，脫水封片。光鏡顯微鏡下，觀察腸系膜動(dòng)脈中AP-1、MCP-1 的蛋白表達(dá)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者采用方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方七芍降壓片對SHR 大鼠體質(zhì)量的影響 給藥前，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠體質(zhì)量在前4 周上升較快，之后增加有所減慢，可能與年齡增長有關(guān)，提示藥物治療6 周對大鼠體質(zhì)量影響較小。見圖1。

3.2 復(fù)方七芍降壓片對SHR 大鼠收縮壓的影響 給藥前，與正常對照組比較，模型組、厄貝沙坦片組、復(fù)方七芍降壓片組大鼠收縮壓更高（P＜0.01）。藥物治療后，與正常對照組比較，模型組大鼠各周收縮壓均上升（P＜0.01）；與模型組比較，厄貝沙坦片組和復(fù)方七芍降壓片組大鼠各周收縮壓均下降（P＜0.01），以厄貝沙坦片組降壓效果更優(yōu)。見圖2。

圖2 復(fù)方七芍降壓片對SHR 大鼠收縮壓的影響

3.3 復(fù)方七芍降壓片對SHR 大鼠腸系膜動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的影響 正常對照組大鼠動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞扁平，排列整齊、緊密，體積較小，偶見散落的內(nèi)皮細(xì)胞，核正常；平滑肌細(xì)胞形狀規(guī)則，均勻分布，細(xì)胞核完整，核膜光滑，染色質(zhì)分布均勻；細(xì)胞外基質(zhì)較少，無明顯的膠原纖維。與正常對照組比較，模型組大鼠動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞與動(dòng)脈內(nèi)膜脫離，體積增大，細(xì)胞核水腫，呈高柱狀突入血管管腔；平滑肌細(xì)胞增多，呈不規(guī)則形狀，體積顯著增大，排列不規(guī)則，細(xì)胞核固縮凋亡；細(xì)胞外基質(zhì)及膠原纖維明顯增多。治療6 周后，與模型組比較，厄貝沙坦片組和復(fù)方七芍降壓片組大鼠動(dòng)脈得到顯著改善，內(nèi)皮細(xì)胞體積明顯縮小，與動(dòng)脈內(nèi)膜連接較為緊密，細(xì)胞核顯著減小，未見呈高柱狀突入血管管腔的內(nèi)皮細(xì)胞；平滑肌細(xì)胞分布均勻，體積未見明顯增大，形狀較為規(guī)則，細(xì)胞核略有皺縮；細(xì)胞外基質(zhì)及膠原纖維增多不明顯。見圖3。

3.4 復(fù)方七芍降壓片對腸系膜動(dòng)脈中AP-1、MCP-1 蛋白表達(dá)影響 正常對照組大鼠動(dòng)脈中陽性染色較弱；模型組大鼠動(dòng)脈陽性染色較強(qiáng)，內(nèi)膜部分脫落，中膜平滑肌細(xì)胞遷移、排列不規(guī)則；厄貝沙坦片組和復(fù)方七芍降壓片組大鼠動(dòng)脈陽性染色較弱，中膜平滑肌細(xì)胞未見明顯增殖，排列整齊，內(nèi)膜損傷得到改善。陽性染色多見細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。與正常對照組比較，模型組大鼠動(dòng)脈中AP-1、MCP-1蛋白表達(dá)均增加（P＜0.01）；與模型組比較，厄貝沙坦片組和復(fù)方七芍降壓片組大鼠動(dòng)脈中AP-1、MCP-1 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）。見圖4～5。

3.5 復(fù)方七芍降壓片對SHR 大鼠血清中IL-8、IL-10 水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠血清中的IL-8 水平升高，IL-10 水平下降（P＜0.01）；與模型組比較，厄貝沙坦片組和復(fù)方七芍降壓片組血清中IL-8 均降低，IL-10水平均升高（P＜0.05）。見圖6。

4 討論

圖3 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈壁超微結(jié)構(gòu)（5 μm）

圖4 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈AP-1、MCP-1 蛋白表達(dá)（免疫組化，×400）

圖5 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈AP-1、MCP-1 平均光密度

圖6 各組大鼠血清中IL-8、IL-10 水平

高血壓是常見的心血管疾病之一，在全球具有較高的發(fā)病率和致死率［7］。炎癥因子（IL-1、IL-8、IL-10、IL-17、腫瘤壞死因子-α 等）可以損傷血管內(nèi)層的內(nèi)皮細(xì)胞及中層的血管平滑肌細(xì)胞，引起血管壁的病理變化（如管腔狹窄等），造成血管阻力升高，在高血壓的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用［8］。因此，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的正常功能，對于保護(hù)血管，防治高血壓極其重要。本研究在電鏡下觀察到，模型組大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞脫落、水腫，平滑肌細(xì)胞增殖、核凋亡，推測在高血壓狀態(tài)下，血管壁發(fā)生病理變化，造成血管阻力升高，升高血壓；與模型組比較，復(fù)方七芍降壓片組內(nèi)皮細(xì)胞體積縮小，與內(nèi)膜連接緊密，平滑肌細(xì)胞分布均勻，體積較正常。

IL-8、IL-10 均為白細(xì)胞介素家族中的一員，與高血壓密切相關(guān)，但I(xiàn)L-8 是一種促炎因子，其對高血壓的病情起著促進(jìn)的作用，其可損傷內(nèi)皮細(xì)胞，與高血壓病情程度呈正相關(guān)［9］；IL-10 是一種抗炎因子，其可以抑制IL-1、IL-8、TNF-α 等促炎因子的產(chǎn)生，減輕炎癥損傷，并可以改善內(nèi)皮功能，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，進(jìn)而降低血壓，改善血管重塑［10-11］。有研究發(fā)現(xiàn)，抵當(dāng)湯可以通過降低高血壓急性期患者血清中IL-8 水平，升高IL-10 水平，來減輕炎癥反應(yīng)，降低血壓［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中炎癥因子IL-8 水平增高、IL-10水平降低，血壓升高，推測在高血壓病理?xiàng)l件下，炎癥水平升高，損傷血管，促進(jìn)高血壓發(fā)展；與模型組比較，復(fù)方七芍降壓片組大鼠血清中炎癥因子IL-8 水平降低、IL-10水平升高，血壓降低。

AP-1 是存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活因子，主要由原癌基因編碼的蛋白質(zhì)Jun 和Fos 組成。在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等不同的細(xì)胞中，AP-1 的激活夠能誘導(dǎo)多種炎癥因子的釋放，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及炎癥細(xì)胞的增殖和遷移，導(dǎo)致管腔狹窄，引發(fā)病理性血管重塑［13］。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素、梔子苷均可以通過抑制AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，抑制炎癥因子（如IL-6、TNF-α、NO 等）的表達(dá)，發(fā)揮抗炎的作用［14-15］；在腸系膜動(dòng)脈中發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可以刺激平滑肌細(xì)胞中c-fos mRNA 表達(dá)，介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞在高血壓中的增殖及遷移作用［16］；MCP-1 是最關(guān)鍵的趨化因子之一，能夠誘導(dǎo)單核／巨噬細(xì)胞浸潤至受損的血管壁，促進(jìn)VSMC 增殖和遷移，引發(fā)血管局部炎癥反應(yīng)，損傷血管；在RNAI 干擾技術(shù)沉默MCP-1 表達(dá)的小膠質(zhì)細(xì)胞中，TNF-α，IL-1β 和IL-6 的表達(dá)降低，減弱了神經(jīng)元損傷［17］。據(jù)研究顯示，小鼠MCP-1 基因啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控序列主要存在于-2600～-1 bp，包括NF-κB、AP-1 等多種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)；血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠增強(qiáng)AP-1 與MCP-1基因啟動(dòng)區(qū)結(jié)合活性，誘導(dǎo)其產(chǎn)生MCP-1［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組大鼠腸系膜動(dòng)脈中AP-1、MCP-1 的蛋白表達(dá)增加，推測在高血壓狀態(tài)下，激活了AP-1 及其與MCP-1 的結(jié)合活性，誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，損傷了血管。與模型組大鼠比較，復(fù)方七芍降壓片組大鼠腸系膜動(dòng)脈中AP-1、MCP-1 的蛋白表達(dá)降低。

在動(dòng)脈粥樣硬化和心肌炎相關(guān)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，脂肪分化相關(guān)蛋白、IL-17 分別可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞中AP-1、MCP-1 蛋白高表達(dá)，促進(jìn)炎癥水平，給予AP-1 抑制劑后，MCP-1 蛋白表達(dá)、炎癥水平降低［5-6］。復(fù)方七芍降壓片降低血壓的機(jī)制可能為通過抑制腸系膜動(dòng)脈中AP-1 活化，在轉(zhuǎn)錄水平抑制MCP-1 的蛋白表達(dá)，降低炎癥因子水平。今后將運(yùn)用AP-1、MCP-1 受體沉默技術(shù)干預(yù)SHR 大鼠，探究在2 種受體沉默時(shí)它對SHR 大鼠血壓及炎癥因子的影響。