姜黃素聯(lián)合5-氟尿嘧啶對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞體外抑制的影響

張閏哲徐 露姚慶華?

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，浙江省中西醫(yī)結(jié)合腫瘤重點實驗室，浙江 杭州 310022）

結(jié)腸癌是指結(jié)腸黏膜上皮或腺體在環(huán)境或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡性病變，是常見的惡性腫瘤之一。結(jié)腸癌是全世界第三大常見癌癥，全球新病例接近120 萬，死亡病例發(fā)生約60.8 萬，占所有癌癥死亡人數(shù)的8%，是造成癌癥死亡的第四大常見原因［1］。

目前，化療是結(jié)腸癌患者治療有效的手段，5-FU 類藥物是治療進(jìn)展期最主要的藥物，然而其化療耐藥是導(dǎo)致患者化療失敗的重要原因，在進(jìn)展期治療中只有10%～15%的效果［2］。因其機(jī)制復(fù)雜，目前尚未得到有效解決。

隨著近年中草藥的發(fā)展，天然植物或者礦物中藥提取的單體有效成分已經(jīng)成為全球研究的熱點［3］。中藥成分姜黃素是中藥姜黃提取的多酚類化合物，具有抗氧化、抗耐藥、抗炎、抗病毒和抗凝作用，尤其它的抗腫瘤作用可以增加化療藥物敏感性，且有普遍研究意義［4-8］。本研究旨在探究姜黃素聯(lián)合5-FU 應(yīng)用于結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞，觀察姜黃素與5-FU 聯(lián)合用藥對SW620 細(xì)胞生長抑制是否具有協(xié)同作用，并初步闡明其機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 姜黃素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號C140600，純度≥65%）；5-FU（美國Selleck 公司，貨號s1209，純度99.97%）；四甲基偶氮哇藍(lán)（MTT，美國Sigma 公司，貨號3580GR001）；DMSO（美國Sigma公司，批號67-68-5）；1640 培養(yǎng)基（美國Gibico 公司，批號8118241）；DMEM 培養(yǎng)基（批號2017062901）、胰蛋白酶消化液（批號2017062802）購于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC／PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司，貨號556547）；Cleaved-Caspase Ab Sampler Kit（美國 CST 公司，批號 8072965）；GAPDH（貨 號sc-32233）、HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗（貨號SA00001-1-A）和兔二抗（貨號SA00001-2）購自美國Proteintech 公司。

1.2 儀器 電熱恒溫水浴箱（型號AODHG-HH-W600）購于山東濟(jì)南赫威科技有限公司；BIOBASE 博科二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號QP-80）、BIOBASE 博科酶標(biāo)儀（型號EL-10 A）均購于山東濟(jì)南飛捷醫(yī)療設(shè)備有限公司；臺式高速低溫離心機(jī)（型號TGL-20M）購于山東濟(jì)南赫威科技有限公司；光學(xué)顯微鏡（型號LB-270）購于北京世聯(lián)博研科技有限公司；流式細(xì)胞儀（型號BD-Accuri-C6）購于北京科譽(yù)興業(yè)科技有限公司；伯樂蛋白電泳儀（型號C1000）購于美國Bio-Rad 公司。

2 方法

2.1 藥物溶液制備 稱取一定量的姜黃素粉劑，DMSO 溶解，配成100 mmol／L 貯備液，-20 ℃保存，使用前用培養(yǎng)液稀釋成所需的濃度，并使所含DMSO 小于0.1%。據(jù)文獻(xiàn)記載，進(jìn)口DMSO 濃度在0.1% 以下對細(xì)胞抑制增殖無影響［9-10］，故本實驗忽略0.1% DMSO 影響，僅設(shè)立空白對照組及姜黃素組。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌SW620、HCT-8、LOVO、HCT-116、SW480 細(xì)胞株均購自浙江省腫瘤研究所。結(jié)腸癌細(xì)胞株在含有10% 胎牛血清的1640 或DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，0.25% 胰蛋白酶消化3 min，以1∶2～1∶4 比例傳代。

2.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖抑制作用 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以3 000／孔接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h；姜黃素組加入姜黃素（1、2、4、8、16、32 μmol／L），5-FU 組加入5-FU（7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1 000 μmol／L），對照組予以含有10% 胎牛血清的1640 或DMEM 培養(yǎng)基；各組繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，加入MTT 孵育4 h，加入DMSO，全自動酶標(biāo)儀測定OD（570 nm），計算細(xì)胞增殖抑制率｛ ［（OD對照組-OD給藥組）／OD對照組］×100%｝。

2.4 姜黃素聯(lián)合5-FU 協(xié)同作用SW620 細(xì)胞的檢測 取對數(shù)生長細(xì)胞，以3 000／孔接種于96 孔板中，預(yù)處理姜黃素聯(lián)合5-FU：細(xì)胞培養(yǎng)24 h，加入姜黃素預(yù)處理24 h，吸出舊培養(yǎng)基，加入5-FU 繼續(xù)干預(yù)48 h，MTT 檢測。姜黃素同時聯(lián)合5-FU：細(xì)胞培養(yǎng)24 h，吸出舊培養(yǎng)基，加入姜黃素和5-FU 共同干預(yù)48 h，MTT 檢測。

Chou-Talalay 又稱中位藥效法（median-drug effect analysis）、聯(lián)合指數(shù)法（combination index method），是用于研究藥物協(xié)同作用的定量分析。2005 年Martin 等［11］對Chou-Talalay 的數(shù)學(xué)模型開發(fā)了第3 代藥物聯(lián)合作用量-效分析軟件“CompuSyn”，且成為當(dāng)代抗腫瘤藥物聯(lián)合作用研究的最普遍方法之一。Chou-Talalay 根據(jù)Median-effect方程（藥物自身藥動學(xué)及藥物之間藥效學(xué)聯(lián)系）衍生出新的數(shù)學(xué)模型［12］，關(guān)于該模型細(xì)節(jié)操作詳見參考文獻(xiàn)［11-14］。

聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）不僅描述藥物拮抗作用、相加作用及協(xié)同作用，同時對定量-效應(yīng)水平下的效應(yīng)進(jìn)行定性描述。Median-effect 方程曾導(dǎo)出兩藥聯(lián)合CI公式為CI＝（D）1／（DX）1+（D）2／（DX）2，D為單用劑量，DX 為聯(lián)合劑量，具體推導(dǎo)公式見參考文獻(xiàn)［12］。如今，在確定藥物數(shù)量、有無拮抗作用和劑量選擇條件下，先根據(jù)MTT 獲得的量-效關(guān)系進(jìn)行等效量和等量效比較，最后應(yīng)用“CompuSyn”（基于Chou-Talalay 模型應(yīng)用），軟件輸入計算CI，從而分析藥物間聯(lián)合效應(yīng)，即CI＞1為拮抗作用，CI＝1 為相加作用，CI＜1 為協(xié)同作用。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測SW620 細(xì)胞的凋亡率 培養(yǎng)對數(shù)生長期細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液（1×105／mL），以2 mL／孔接種于6 孔培養(yǎng)板中，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄去舊培養(yǎng)液，加入含不同濃度姜黃素的培養(yǎng)基1 mL，預(yù)處理24 h 后，棄培養(yǎng)基并分別加入相應(yīng)濃度的氟尿嘧啶培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，500×g離心5 min、PBS洗滌，加入染色緩沖液懸浮細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μL，混勻后再加入PI 染料10 μL，避光室溫反應(yīng)20 min。最后將細(xì)胞放入流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，并計算細(xì)胞凋亡率。

2.6 Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 按照“2.5”項下條件培養(yǎng)細(xì)胞。收集細(xì)胞，RIPA 裂解液提取蛋白。在預(yù)制凝膠板中上樣，電泳100 V、1 h 轉(zhuǎn)膜200 mA、2 h，封閉1 h，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育2 h，最后進(jìn)行圖像采集和分析。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 姜黃素與5-FU 對結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖的抑制作用 MTT結(jié)果顯示，5-FU 處理SW620 細(xì)胞48 h，IC50為（367.20±16.80）μmol／L，其對SW620 細(xì)胞抑制作用較弱（表1～2）；姜黃素（1～32 μmol／L）處理SW620 細(xì)胞24、48 h，能抑制SW620 細(xì)胞增殖（P＜0.01）（表3）。48 h 藥物暴露處理所得的實驗結(jié)果最佳，選擇SW620 細(xì)胞開展姜黃素對5-FU 增敏作用的研究。

表1 5-FU 處理48 h 后對結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖的抑制作用（±s，n＝3）

表1 5-FU 處理48 h 后對結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖的抑制作用（±s，n＝3）

表2 5-FU 對SW620 細(xì)胞增殖的抑制作用（±s，n＝6）

表2 5-FU 對SW620 細(xì)胞增殖的抑制作用（±s，n＝6）

注：與對照組比較，??P＜0.01。

表3 姜黃素對SW620 細(xì)胞增殖的抑制作用（±s，n＝6）

表3 姜黃素對SW620 細(xì)胞增殖的抑制作用（±s，n＝6）

注：與對照組比較，??P＜0.01。

根據(jù)CompuSyn 軟件（www.combosyn.com）計算藥物聯(lián)合的協(xié)同效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)姜黃素能增加SW620 對5-FU 的敏感性，且姜黃素預(yù)處理相比于兩藥同時干預(yù)有更顯著的增敏效果（表4～5），劑量-效應(yīng)曲線見圖1～2。

表4 姜黃素同時聯(lián)合5-FU 對SW620 協(xié)同效應(yīng)的影響

表5 預(yù)處理姜黃素聯(lián)合5-FU 對SW620 協(xié)同效應(yīng)的影響

圖1 姜黃素同時聯(lián)合5-FU 處理SW620 效應(yīng)曲線

圖2 預(yù)處理姜黃素聯(lián)合5-FU 處理SW620 效應(yīng)曲線

3.2 姜黃素與5-FU 聯(lián)用對SW620 凋亡的影響 姜黃素預(yù)處理組比同時用藥聯(lián)合組對SW620 生長抑制更明顯，因此采取姜黃素預(yù)處理培養(yǎng)細(xì)胞的方法進(jìn)行凋亡檢測。流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，聯(lián)用給藥組誘導(dǎo)SW620 細(xì)胞凋亡（P＜0.05，P＜0.01），見表6、圖3。

3.3 姜黃素與5-FU 聯(lián)用對SW620 細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)影響 單用姜黃素對SW620 細(xì)胞內(nèi)caspase 家族蛋白表達(dá)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），單用5-FU 促進(jìn)cleaved-PARP 和cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)（P＜0.05），應(yīng)用姜黃素預(yù)處理與5-FU 聯(lián)用促進(jìn)SW620 細(xì)胞caspase 家族相關(guān)凋亡蛋白（cleaved-PARP、cleaved-caspase3、cleaved-caspase6、cleaved-caspase9）表達(dá)（P＜0.01），見圖4、表7。由此提示，姜黃素與氟尿嘧啶（5-FU）聯(lián)用可以協(xié)同誘導(dǎo)SW620細(xì)胞內(nèi)相關(guān)促凋亡蛋白表達(dá)。

4 討論

5-FU 作為結(jié)直腸癌治療最普遍、療效相對高的化療藥物［15］，它在人體內(nèi)會轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶脫氧核苷酸，繼而抑制胸腺嘧啶核苷合成酶，從而阻斷尿嘧啶脫氧核苷轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏っ撗鹾塑眨罱K影響DNA 和RNA 的合成［16］。但5-FU 的長期應(yīng)用會導(dǎo)致胃腸及血液系統(tǒng)的毒副作用，甚至產(chǎn)生對5-FU 的藥物耐受，這會嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量及抗腫瘤治療［17］。

表6 姜黃素聯(lián)合5-FU 對SW620 凋亡率的影響（±s，n＝3）

表6 姜黃素聯(lián)合5-FU 對SW620 凋亡率的影響（±s，n＝3）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU 產(chǎn)生耐受是化療藥物療效降低的重要原因之一。已有相關(guān)研究［18］證實，姜黃素主要通過調(diào)節(jié)抑癌基因和原癌基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥等途徑表現(xiàn)抗腫瘤活性。同時，發(fā)現(xiàn)姜黃素能上調(diào)P53 和Bax，下調(diào)Bcl-2，由此誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡［19］。此外，Mehdi 等［20］發(fā)現(xiàn)5-FU 與姜黃素的聯(lián)合應(yīng)用可以阻斷結(jié)腸癌發(fā)展，結(jié)果顯示，在聯(lián)用的情況下，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞存活率顯著降低，產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯并誘導(dǎo)凋亡。此外，還觀察到姜黃素可通過NF-κB 信號通路增強(qiáng)5-FU 對結(jié)腸癌細(xì)胞株生長抑制和促凋亡作用。諸多研究表明，姜黃素作為中藥的提取成分，雖不及化療藥物療效但也具備抗腫瘤作用。因此，探索姜黃素與5-FU 聯(lián)用對抗腫瘤作用的研究有重大意義，本研究也將為姜黃素作為未來臨床輔助化療藥的增效劑提供理論依據(jù)。

圖3 姜黃素聯(lián)合5-FU 誘導(dǎo)SW620 凋亡的流式圖

圖4 姜黃素聯(lián)用5-FU 對SW620 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)

在本研究中，首先通過MTT 法對5-FU 抑制結(jié)腸癌相關(guān)細(xì)胞株HCT-8、HCT-116、LOVO、SW480、SW620 的生長作用進(jìn)行對比，得到5-FU 處理以上細(xì)胞株48 h，IC50分別為24.62、12.38、4.53、18.49、367.20 μmol／L。由此可知，相比于其他4 株細(xì)胞，SW620 對5-FU 的敏感性較弱，針對其展開后續(xù)增敏相關(guān)實驗更具有臨床依據(jù)及意義。從細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)等幾個方面分析姜黃素與5-FU 聯(lián)用對SW620 抑制作用。通過CompuSyn軟件計算分析發(fā)現(xiàn)兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時，姜黃素可明顯增進(jìn)5-FU 對SW620 的殺傷作用，而預(yù)處理24 h 相比于同時用藥有更明顯的效果。為進(jìn)一步了解姜黃素與5-FU 抑制SW620 增殖的機(jī)制，利用FITC-Annexin V／ PI 雙染流式細(xì)胞技術(shù)對SW620 細(xì)胞凋亡進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示兩藥聯(lián)用（預(yù)處理組）比單藥處理發(fā)生的凋亡更顯著，提示姜黃素可能通過誘導(dǎo)SW620 凋亡來增加其對5-FU 的敏感性。8 μmol／L姜黃素預(yù)處理與5 μmol／L氟尿嘧啶（5-FU）聯(lián)用組能上調(diào)SW620 細(xì)胞內(nèi)caspase 家族相關(guān)蛋白表達(dá)，說明預(yù)處理姜黃素與5-FU 聯(lián)用能協(xié)同誘導(dǎo)SW620 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)。

表7 姜黃素聯(lián)用5-FU 對SW620 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)（±s，n＝3）

表7 姜黃素聯(lián)用5-FU 對SW620 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)（±s，n＝3）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

綜上所述，預(yù)處理姜黃素聯(lián)用5-FU 協(xié)同增強(qiáng)對SW620細(xì)胞株的殺傷作用，其機(jī)制與caspase 半胱氨酸蛋白酶家族有關(guān)。有研究［21］顯示，腺病毒載體導(dǎo)人caspase-3 基因在獲得性藥物抗性（acquired drug resistance，ADR）的MCF-7細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)ADR 細(xì)胞比轉(zhuǎn)入前caspase-3 蛋白表達(dá)增加，同時也發(fā)現(xiàn)前體caspase-3 高表達(dá)，對藥物的敏感性強(qiáng)。表示caspase 在未來治療惡性腫瘤化療藥耐藥性方面具有重要實際意義，且用caspase 相關(guān)誘導(dǎo)凋亡的方法治療腫瘤將有新的潛能和突破。本實驗為臨床上姜黃素作為結(jié)腸癌化療藥5-FU 的增效劑，減少毒副作用和耐藥性提供了初步實驗依據(jù)，但仍需要進(jìn)一步的研究驗證。