金橘質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

黃華花，王明軍，黃鳴清，王圣江，呂詩詩

（1.廈門醫(yī)學(xué)院，福建省中藥精加工與健康產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)研究室，廈門市中藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361023；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122）

金橘是蕓香科植物金橘Fortunella margarita（Lour.）Swingle 的成熟果實(shí)，《中華本草》 記載其性溫，味辛、甘，具理氣解郁、消食化痰、醒酒之功效，主治胸悶郁結(jié)、脘腹痞脹、食滯納呆、咳嗽痰多、傷酒口渴等癥［1］，常鮮食、泡水飲用，亦被開發(fā)成金桔利口酒、金栆丹、金山開胃丸、金桔咀嚼片等制劑［2-5］。目前，金橘藥用方面的研究主要集中在藥理活性和成分分離［6-11］，具有抗炎鎮(zhèn)痛、化痰止咳、調(diào)節(jié)免疫、預(yù)防結(jié)石、解酒保肝等作用［12-15］，黃酮為其活性成分，包括金柑苷、柚皮素、根皮苷、野漆樹苷、4′-甲氧基-牡荊素-2″-O-α-L-鼠李糖苷、4′-甲氧基-異牡荊素-2″-O-α-L-鼠李糖苷等［16-18］，其中金柑苷至今僅在金橘中有過報(bào)道，而且含有量較高，為其特征性成分；野漆樹苷具有抗炎、抗氧化、降壓等作用［19］。但目前尚無金橘質(zhì)量控制方面的報(bào)道，更缺少相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，故本實(shí)驗(yàn)首次建立該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 E200 型顯微鏡（日本尼康公司）；Scopelmage 9.0 圖像采集軟件（寧波永新光學(xué)股份有限公司）；WD-9403C 型紫外儀（北京市六一儀器廠）；H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；CPA225D、BS224S 型電子天平（德國Sartorius公司）；KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 10 批金橘（編號(hào)S1～S10）具體信息見表1，經(jīng)廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系鮑紅娟副教授鑒定為蕓香科植物金橘Fortunella margarita（Lour.）Swingle 的成熟干燥果實(shí)，橫切制片委托河南雨林教育工程有限公司制作。野漆樹苷（批號(hào)Z23M9X56843，純度＞98%）、金柑苷（批號(hào)Q14M10Q73839，純度＞98%）對(duì)照品均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水（Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司）。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 觀察金橘大小、顏色、表面，聞其氣味，嘗其味道，并進(jìn)行描述。

2.1.1 鮮金橘 本品呈卵球形，直徑2～4 cm；外果皮橘黃色，有顆粒樣凸起；橫切面上中果皮黃白色，瓢囊5～7瓣，內(nèi)藏種子；氣清香，味辛、酸、甘。見圖1A。

2.1.2 金橘片 本品呈卵圓形，直徑1.1～2.0 cm，厚0.15～0.4 cm；全體皺縮，彎曲，外果皮橘黃色，中果皮黃色，內(nèi)果皮黃白色，凸起；種子廣橢圓形，長0.6～1 cm，直徑0.3～0.5 cm，表面淡黃白色；質(zhì)稍硬脆，氣香，味辛、酸、甘。見圖1B。

2.2 顯微鑒別

圖1 鮮金橘（A）、金橘片（B）性狀特征

2.2.1 組織橫切面特征 取金橘橫切制片，在顯微鏡下觀察，顯微成像系統(tǒng)記錄橫切面顯微特征，結(jié)果見圖2。由圖可知，外果皮細(xì)胞單層，排列緊密，角質(zhì)化；中果皮為薄壁細(xì)胞，較寬廣，含有分泌囊，草酸鈣方晶散在或成行排列，有限外韌型維管束散在；內(nèi)果皮薄壁細(xì)胞3～4 層，細(xì)胞小，排列緊密。

圖2 金橘橫切面顯微特征

2.2.2 粉末特征 制作水合氯醛透化片，顯微鏡下觀察，顯微成像系統(tǒng)記錄粉末顯微特征，結(jié)果見圖3。由此可知，粉末中中果皮薄壁組織多，細(xì)胞不規(guī)則；外果皮細(xì)胞側(cè)面觀外被角質(zhì)層；正面觀呈多角形，偶見氣孔；草酸鈣方晶多，呈多面形；孔紋導(dǎo)管、螺紋導(dǎo)管較??；偶見石纖維及石細(xì)胞。

2.3 TLC 定性鑒別 精密稱取藥材粉末1 g，加75%甲醇10 mL，超聲（900 W、40 kHz）提取30 min，濾過，蒸干，加2 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液；另取金柑苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.10 mg 該成分的對(duì)照品溶液。按照2015 年版《中國藥典》 四部報(bào)道的方法［20］，分別吸取2 μL 上述溶液，點(diǎn)于硅膠G 板上，三氯甲烷-甲醇-水（3∶1∶0.1）展開，5% AlCl3乙醇溶液顯色，105 ℃下加熱1 min，365 nm 下檢視，結(jié)果見圖4。由此可知，供試品色譜在對(duì)照品相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.4 檢查項(xiàng) 參照2015 年版 《中國藥典》 四部通則0832、2302、2201，對(duì)水分（第四法）、總灰分、酸不溶灰分、浸出物（醇溶性浸出物，熱浸法，乙醇作為溶劑）含有量進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

2.5 野漆樹苷、金柑苷含量有測定

2.5.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取野漆樹苷、金柑苷對(duì)照品適量，75%甲醇制成每1 mL 分別含兩者4.0、82 μg 的貯備液，吸取3 mL，稀釋至10 mL，即得。

2.5.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末0.5 g，精密加入75% 甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。?00 W、40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

圖3 金橘粉末顯微特征（40×）

2.5.3 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，15% →35% A）；體積流量0.3 mL／min；檢測波長337 nm；進(jìn)樣量2 μL。色譜圖見圖5。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液 0.5、1、1.5、2、2.5 mL，稀釋至 5 mL，在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積對(duì)溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 金橘TLC 色譜圖

表2 水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含有量測定結(jié)果（n＝2）

2.5.5 檢測限、定量限 精密吸取“2.5.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋，在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，野漆樹苷、金柑苷檢測限（S／N＝3）分別為0.12、0.27 μg／mL，定量限（S／N＝10）分別為0.24、0.55 μg／mL。

圖5 各成分UPLC 色譜圖

表3 各成分線性關(guān)系

2.5.6 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S10），在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得野漆樹苷、金柑苷峰面積RSD 分別為0.40%、0.17%，表明儀器精密度良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S10），室溫下于0、2、4、8、10、12、24 h 在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得野漆樹苷、金柑苷含有量RSD 分別為2.01%、0.50%，表明溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品（S10）0.5 g，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得野漆樹苷、金柑苷含有量RSD 分別為2.01%、0.46%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的供試品（S10）9 份，每份0.25 g，按80%、100%、120%水平加入“2.5.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液，每個(gè)水平3 份，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

2.5.10 樣品含有量測定 按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備10批樣品的供試品溶液，在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表5。最小顯著性差異（LSD）檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣品S3～S7、S10 中野漆樹苷含有量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；樣品S4、S5 及S6、S7 中金柑苷含有量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

3.1 TLC 定性鑒別 本實(shí)驗(yàn)以金橘特征性成分金柑苷為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)其斑點(diǎn)清晰，與其他斑點(diǎn)分離情況良好，而且操作簡便快速，可作為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別項(xiàng)目之一。參考文獻(xiàn)［21-23］，本實(shí)驗(yàn)比較乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（10∶1.7∶1∶0.5）、乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（10∶1.7∶1∶0.5）與甲苯-乙酸乙酯（5∶5）的二次展開系統(tǒng)、三氯甲烷-甲醇-丙酮（15∶3.5∶1.5）、三氯甲烷-甲醇-水（3∶1∶0.1）4 種展開體系，發(fā)現(xiàn)以三氯甲烷-甲醇-水（3∶1∶0.1）為展開劑時(shí)斑點(diǎn)更清晰，分離度更好；比較了硅膠G、聚酰胺2 種薄層板的展開效果，發(fā)現(xiàn)前者更理想。

3.2 液相色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)75%甲醇超聲提取30 min 時(shí)，野漆樹苷、金柑苷含有量最高。研究表明［24］，野漆樹苷最大吸收波長為266、337 nm，而金柑苷為267、333 nm，由于金橘中前者含量較低，故為了增大其響應(yīng)值最終選擇337 nm。然后，考察了流動(dòng)相乙腈-水、甲醇-水，發(fā)現(xiàn)2 種系統(tǒng)中各成分分離度均較好，但前者流動(dòng)相系統(tǒng)出峰較快，同時(shí)檢測一段時(shí)間后色譜峰出現(xiàn)叉峰，故又加入0.1%磷酸，從而峰形、穩(wěn)定性得到改善。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

表5 各成分含有量測定結(jié)果（±s，n＝3）

表5 各成分含有量測定結(jié)果（±s，n＝3）

3.3 水分、總灰分、浸出物限量標(biāo)準(zhǔn) 10 批金橘中水分平均含有量為6.66%，總灰分平均含有量為3.63%，以120%設(shè)限，擬定兩者分別不得超過8.0%、4.5%；酸不溶性灰分平均含有量為0.11%，鑒于用藥部位為果實(shí)，而且測得值均較低，故建議不設(shè)定該檢查項(xiàng)；醇溶性浸出物平均含有量為29.09%，以80% 設(shè)限，擬定其不得少于23.0%。

3.4 野漆樹苷、金柑苷限量標(biāo)準(zhǔn) 10 批金橘中野漆樹苷、金柑苷平均含有量分別為0.053、0.979 mg／g，但不同產(chǎn)地藥材中兩者含有量存在較大差異，故其限量取平均值的80%，即按干燥品計(jì)算，野漆樹苷、金柑苷含有量分別不得少于0.04、0.80 mg／g。