UPLC-QQQ-MS／MS 法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地知母中10 種成分

趙小勤，許 莉，文永盛，高 鵬，黃曉婧

（成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610045）

知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖，具有清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥等功效，臨床用于外感熱病、高熱煩渴、肺熱燥咳，內(nèi)熱消渴等癥［1］，具有抑制血小板聚集［2-4］、降血糖［5-7］、抗抑郁［8-10］和抗阿爾茲海默?。?1-13］等藥理作用。知母含有甾體皂苷、黃酮類、木脂素類、生物堿、多糖及有機(jī)酸等成分，其中主要活性物質(zhì)為甾體皂苷和黃酮類，兩者也是其重要的藥理活性物質(zhì)群，對(duì)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制至關(guān)重要［14-16］。

2015 年版《中國(guó)藥典》 采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-ELSD）測(cè)定知母甾體皂苷類成分知母皂苷BⅡ的含有量，高效液相色譜-紫外光檢測(cè)法（HPLC-UV）測(cè)定黃酮類成分芒果苷的含有量［1］，但質(zhì)量控制指標(biāo)較單一，指標(biāo)性成分的代表性不夠，很難反映藥材整體質(zhì)量。知母中含有的大部分甾體皂苷類成分無紫外吸收，故紫外檢測(cè)器不適用于含有量測(cè)定，同時(shí)這些成分在蒸發(fā)光散射檢測(cè)器上的響應(yīng)也較低［17-19］，因此，HPLC-UV 或HPLC-ELSD 都不是最佳的定量分析方法。超高效液相質(zhì)譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-QQQ-MS／MS）具有分析時(shí)間短、分離度好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于中藥多組分的分析，本研究建立該方法同時(shí)測(cè)定知母中10種成分的含有量，以期為該藥材及其成藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 超高效液相色譜儀串聯(lián)／6470 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；AUX220 電子天平（萬分之一，日本島津公司）；XPE26 電子天平（百萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；SK250H 超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 芒果苷（純度98.4%，111607-201503）、知母皂苷B Ⅱ（純度94.4%，111839-201505）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；新芒果苷（純度99.73%，MUST-16042232）、異芒果苷（純度99.81%，MUST-16100905）、知母皂苷AⅠ（純度98.00%，MUST-17022810）、知母皂苷AⅡ（純度99.59%，MUST-16112415）、知母皂苷AⅢ（純度98.78%，MUST-16020108）、知母皂苷BⅢ（純度96.93%，MUST-17022210）、知母皂苷E1（純度99.15%，MUST-17031401）、知母皂苷Ⅰ（純度99.15%，MUST-17031401）對(duì)照品均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲酸（質(zhì)譜純，美國(guó)Fisher 公司）；水為超純水。20 批知母實(shí)地采自山西、河北、陜西、內(nèi)蒙古等道地產(chǎn)區(qū)，經(jīng)成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院文永盛中藥師鑒定為百合科知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖，具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品貯備液制備 精密稱取新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷AⅠ、知母皂苷AⅡ、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷E1、知母皂苷Ⅰ適量，加50%甲醇分別配制 成 2.168、1.628、1.804、1.200、1.540、1.810、3.396、1.564、3.208、3.892 mg／mL，即得，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液 取本品粉末（過3 號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，立即超聲處理（250 W、53 kHz）40 min，放冷，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液1 mL 置于50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，再取1 mL 溶液置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，即得。

2.3 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相0.01% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，93% A；3～7.5 min，93%～87% A；7.5～8 min，87%～78% A；8～11 min，78%～65% A；11～12.5 min，65%～55% A；12.5～18 min，55%～20% A；18～20 min，20%～5% A；20～22 min，5% A；22～22.5 min，5%～93% A；22.5～25 min，93% A）；體積流量0.4 mL／min；進(jìn)樣量2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 ESI 離子源，正、負(fù)離子交替掃描；MRM 檢測(cè)模式；毛細(xì)管電壓3 000 V（+）、3 000 V（-）；噴霧器壓力172.368 925 kPa；干燥氣溫度350 ℃，體積流量8 L／min；EMV 750。總離子流圖見圖1，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷E1、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅠ、知母皂苷AⅡ、知母皂苷AⅢ貯備液適量，50%甲醇逐級(jí)稀釋，各精密吸取2 μL，在“2.3”“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，以信噪比（S／N）3 為最低檢出限（LOD），信噪比（S／N）10 為最低 定量限（LOQ），結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取含有量已知的新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷E1、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅠ、知母皂苷A Ⅱ、知母皂苷A Ⅲ對(duì)照品溶液，在“2.3”“2.4”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次2 μL，測(cè)得10 種成分峰面積RSD 分別為0.68%、0.98%、1.21%、1.25%、0.45%、0.96%、1.51%、2.19%、1.83%、1.96%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of various constituents

表2 10 種成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters for ten constituents

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品粉末6 份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷E1、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅠ、知母皂苷AⅡ、知母皂苷AⅢ含有量RSD 分別為1.38%、1.14%、1.64%、2.07%、1.29%、2.00%、1.17%、1.57%、1.75%、0.53%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”“2.4”項(xiàng)條件下于0、4、8、16、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷E1、知母皂苷B Ⅱ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅠ、知母皂苷A Ⅱ、知母皂苷A Ⅲ峰面積RSD 分別為0.37%、0.33%、2.01%、1.26%、1.14%、0.62%、1.26%、2.53%、1.97%、1.05%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的同一樣品粉末9 份，每份約0.1 g。取新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷E1、知母皂苷B Ⅱ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅠ、知母皂苷AⅡ、知母皂苷AⅢ對(duì)照品，配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，以原含有量的50%、100%、150%加到樣品粉末中，平行3 份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得10 種成分的平均加樣回收率分別為97.18%、97.30%、97.07%、99.84%、99.15%、98.51%、97.80%、98.39%、99.42%、101.31%，RSD 分別為 1.90%、1.52%、2.09%、1.62%、1.22%、2.59%、2.53%、2.18%、1.19%、1.99%。

2.10 樣品含有量測(cè)定 對(duì)20 批樣品粉末進(jìn)行精密稱取，每批約0.2 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各精密吸取2 μL，在“2.3”“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算含有量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g，n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

2.11 不同產(chǎn)地知母差異成分分析 本研究以知母中10 種成分含有量為變量，采用多元變量統(tǒng)計(jì)分析軟件SIMCA 14.1，通過正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）建立20 批樣品模型，發(fā)現(xiàn)陜西和山西產(chǎn)聚為一類，河北和內(nèi)蒙古產(chǎn)聚為一類，見圖2。OPLS-DA 載荷圖的每個(gè)點(diǎn)代表1 種化學(xué)成分，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，權(quán)重值越大，在決定樣品區(qū)分中的作用越大，見圖3。進(jìn)一步作VIP 分析可知，各成分貢獻(xiàn)值依次為知母皂苷AⅡ、異芒果苷、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷BⅢ、新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅢ、知母皂苷AⅠ、知母皂苷E1、知母皂苷BⅡ，其中知母皂苷AⅡ、異芒果苷、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷BⅢ的VIP＞1，表明這4 種成分是區(qū)分不同產(chǎn)地知母的主要標(biāo)志物，見圖4。取20 批樣品各成分含有量的平均值，繪制成柱狀圖，見圖5。

3 討論與結(jié)論

圖2 各樣品OPLS-DA 得分散點(diǎn)圖Fig.2 OPLS-DA score scatter plot for various samples

圖3 各成分OPLS-DA 載荷散點(diǎn)圖Fig.3 OPLS-DA score load diagram for various constituents

圖4 各成分OPLS-DA VIP 圖Fig.4 OPLS-DA VIP diagrams for various constituents

2015 年版《中國(guó)藥典》 知母含有量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定，按干燥品計(jì)算，含芒果苷（C19H18O11）不得少于0.70%，知母皂苷BⅡ（C45H76O19）不得少于3.0%［1］，本實(shí)驗(yàn)中僅有1 批樣品（安國(guó)石佛鎮(zhèn)，S11）知母皂苷BⅡ含有量不達(dá)標(biāo)。前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，藥農(nóng)通常在知母種植2～3 年時(shí)采收，但價(jià)格高時(shí)會(huì)提前，價(jià)格低時(shí)會(huì)延后，河北產(chǎn)地一般種植年限為3 年，而樣品S11 為2 年。有文獻(xiàn)報(bào)道，知母中芒果苷含有量隨種植年限延長(zhǎng)而降低［20］，皂苷類成分含有量隨種植年限延長(zhǎng)而升高［21］，但樣品S11 中芒果苷較高，知母皂苷BⅡ較低，其原因可能是種植年限較短，故建議規(guī)范知母的種植年限和采收時(shí)間。知母皂苷BⅡ具有抗氧化［22-23］、抗抑郁［9］、抗腫瘤［24-25］等藥理作用，芒果苷具有抗炎、降血糖、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用［15］，兩者為《中國(guó)藥典》 規(guī)定的質(zhì)控指標(biāo)；知母皂苷AⅢ具有抗腫瘤［26-27］、抗血栓［28］、改善學(xué)習(xí)記憶［29］等顯著的藥理活性，特別是能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞、Hela細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、黑色素瘤、腦膠質(zhì)瘤及胰腺癌細(xì)胞的凋亡［26-27］，成為近年來研究的熱點(diǎn)，可將其也作為知母的質(zhì)控指標(biāo)。

圖5 各成分含有量柱狀圖Fig.5 Historgram for various constituents’contents

最初，課題組嘗試采用HPLC-ELSD 法同時(shí)測(cè)定知母中多指標(biāo)成分含有量［17］，但多數(shù)皂苷響應(yīng)值較低，供試品取樣量大，定量計(jì)算較困難，因此嘗試建立基于UPLC-QQQ-MS／MS 的多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)方法。除10 種成分外，本研究還考察了知母皂苷C、知母皂苷E、寶藿苷Ⅰ、構(gòu)樹寧的質(zhì)譜條件，發(fā)現(xiàn)其響應(yīng)值較低，供試品中未檢出，故暫未將其列入，需進(jìn)一步研究。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了基于UPLC-QQQ-MS／MS 多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)知母質(zhì)量的方法，其簡(jiǎn)單快速，準(zhǔn)確度好，靈敏度高，可為藥材相關(guān)研究提供參考。