淫羊藿根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

段 萍，萬紅才，徐作剛，羅洪蓮，劉曉艷，徐文芬

（1.黔南州檢驗(yàn)檢測院，貴州 都勻 558000；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550000）

淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim 最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］，生于海拔200～1 800 m 的山坡、草叢、灌叢、溝谷、巖石縫、林下等，分布于貴州、四川、長江流域中下游及南方各省區(qū)，其根為應(yīng)用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥，也是貴州常用的苗藥，重在補(bǔ)虛、祛風(fēng)濕，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、助陽益精等功效，主治腎虛陽痿、小淋瀝、喘咳、風(fēng)濕痹痛。淫羊藿含有多種黃酮類活性成分，主要是8-異戊烯基黃酮，為該屬植物特有的黃酮類成分，包括雙藿苷A、淫羊藿屬苷A、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿屬苷C 等，目前從巫山淫羊藿根、粗毛淫羊藿根、黔嶺淫羊藿根也分離到該類化合物；淫羊藿總黃酮具有抑制破骨細(xì)胞、促進(jìn)成骨細(xì)胞生長、抗抑郁、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抑菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等藥理活性［2-4］。

2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》 收載了箭葉淫羊藿、巫山淫羊藿、粗毛淫羊藿、柔毛淫羊藿、天平山淫羊藿、氈毛淫羊藿、光葉淫羊藿的干燥根作為藥用資源［5］，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀描述。本實(shí)驗(yàn)對(duì)淫羊藿根來源、性狀、鑒別、檢查、含有量測定等方面進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 儀器 TΜ-1901 紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；UV-2600 紫外分光光度計(jì)、2010 AHT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；SK250LHC 超聲波清洗器（上海科導(dǎo)儀器有限公司）；卡瑪TLC PLATE HEATER Ⅲ薄層板加熱器；AG135 電子天平（十萬分之一）、AL204 電子天平（萬分之一）（瑞士梅特勒-托利多公司）；安捷倫1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試劑與藥物 朝藿定C（純度92.6%，批號(hào)111780-201803）、淫羊藿苷（純度94.2%，批號(hào)110737-201516）對(duì)照品均購于中國食品藥品檢定研究院，2～10 ℃冷藏；硅膠G 板、硅膠GF254板、硅膠H 板均為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)。乙腈為色譜純；稀乙醇為50% 乙醇；其他試劑為分析純；水為娃哈哈純凈水。樣品洗凈后曬干，粉碎，過3 號(hào)篩，置于干燥器中保存，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院何順志教授、王悅云副教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 來源 本品為淫羊藿屬中8 個(gè)品種的干燥根，夏、秋兩季采挖，洗凈，曬干。具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.2 性狀 對(duì)8 個(gè)品種淫羊藿根的性狀進(jìn)行描述，結(jié)果見表2。

2.3 鑒別

2.3.1 顯微鑒別 本品粉末棕黃色；導(dǎo)管成束或散在，直徑10～50 μm，螺紋或網(wǎng)紋，導(dǎo)管分子穿孔板上具多數(shù)圓形孔；薄壁細(xì)胞類方形、類長方形、不規(guī)則形，壁稍厚，具紋孔，多含黃棕色分泌物；木栓細(xì)胞類長方形、類方形，直徑10～50 μm，具紋孔；木纖維成束或單個(gè)散在，呈寬披針形。見圖1。

2.3.2 薄層色譜 取本品細(xì)粉0.2 g，加乙醇10 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液；另取朝藿定C對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 該成分的對(duì)照品溶液。按照2015 年版《中國藥典》 四部通則0502 薄層色譜法，吸取上述2 種溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（27∶12∶4）下層澄清溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜在對(duì)照品相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，見圖2。

2.4 檢查 按照2015 年版《中國藥典》 四部通則，對(duì)水分（通則0832 第二法）、總灰分（通則2302）、酸不溶性灰分（通則2302）進(jìn)行檢查，結(jié)果見表3。由于淫羊藿圓柱型根分支少，易清洗；結(jié)節(jié)型根包裹雜質(zhì)較多，不易清洗，導(dǎo)致總灰分、酸不溶性灰分測定結(jié)果偏差較大，暫定水分含有量不得超過12.0%，總灰分含有量不得超過9.0%，酸不溶性灰分含有量不得超過6.0%。

表2 淫羊藿根外觀性狀Tab.2 Appearance characteristics of the roots of E.brevicornu

圖1 淫羊藿根顯微鑒別Fig.1 Microscopic identification of the roots of E.brevicornu

2.5 浸出物 按照2015 年版《中國藥典》 四部通則2201 項(xiàng)下醇溶性浸出物測定法中的熱浸法測定，用稀乙醇作為溶劑，結(jié)果見表3，暫定浸出物含有量不得少于18.0%。

圖2 淫羊藿根TLC 色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of the roots of E.brevicornu

2.6 含有量測定

2.6.1 總黃酮［6］

2.6.1.1 測定方法 精密量取朝藿定C 測定項(xiàng)下的供試品溶液0.5 mL，置于50 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含10 μg該成分的對(duì)照品溶液。取2 種溶液，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法（通則0401）在270 nm 波長處測定吸光度，計(jì)算含有量。

2.6.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品10.43 mg，置于100 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，作為貯備液，精密量取1 mL，置于10 mL 量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，即得（9.825 1 μg／mL）。

2.6.1.3 供試品溶液制備 精密量取朝藿定C 測定項(xiàng)下的供試品溶液0.5 mL，置于50 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.6.1.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.6.1.2”項(xiàng)下貯備液，甲醇制成1.965、4.913、9.825、19.650、29.475 μg／mL，按“2.6.1.1”項(xiàng)下方法測定吸光度。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得回歸方程為Y＝0.041 5X+0.007 4（r＝0.999 9），在1.965～29.475 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物測定結(jié)果Tab.3 Determination results of moisture，total ash，acid insoluble ash and extract

2.6.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.6.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.6.1.1”項(xiàng)下方法測定吸光度6 次，測得其RSD 為0.01%，表明儀器精密度良好。

2.6.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（S1），按“2.6.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.6.1.1”項(xiàng)下方法于0、6、12、16、20 h 測定吸光度，測得其RSD為0.7%，表明溶液在20 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.6.2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，各取0.5 mL 置于50 mL量瓶中，按“2.6.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.6.1.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，測得淫羊藿苷含有量RSD 為1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取淫羊藿苷對(duì)照品78.22 mg，置于150 mL 量瓶中，加稀乙醇至刻度，作為回收對(duì)照品溶液（491.22 μg／mL）。取6 份樣品（S1），每份約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入回收對(duì)照品溶液20 mL，按“2.6.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.6.1.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 總黃酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests for total flavonoids

2.6.1.9 樣品含有量測定 取15 份供試品溶液，各量取0.5 mL，置于50 mL 量瓶中，按“2.6.1.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，以淫羊藿苷為基準(zhǔn)計(jì)算含有量（按干燥品計(jì)），結(jié)果見表5。參照2015 年版《中國藥典》 一部淫羊藿總黃酮測定項(xiàng)下規(guī)定限度，建議將含有量限度暫定為按干燥品計(jì)算，含淫羊藿苷（C33H40O15）不得少于6.0%。

表5 各成分含有量測定結(jié)果（%）Tab.5 Results of content determination of various constituents（%）

2.6.2 朝藿定C［7-9］

2.6.2.1 色譜條件 十八烷基鍵合硅膠色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水（25∶75）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長270 nm；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按朝藿定C峰計(jì)，應(yīng)不低于3 000。見圖3～4。

2.6.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取朝藿定C 對(duì)照品13.17 mg，置于25 mL 量瓶中，稀乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，作為貯備液，量取5 mL，置于10 mL量瓶中，乙醇稀釋至刻度，即得（0.244 mg／mL）。

2.6.2.3 供試品溶液制備 取樣品（S1）約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，靜置過夜，超聲60 min，放冷，稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

圖3 淫羊藿根HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of the roots of E.brevicornu

圖4 各樣品HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of various samples

2.6.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.6.2.2”項(xiàng)下貯備液 2、4、8、12、16、20 μL，在“2.6.2.1”項(xiàng)色譜條件下測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝1 766.284X-121.810（r＝1.000 0），在0.976～9.756 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.6.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.6.2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得朝藿定C 峰面積RSD 為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.6.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（S1），在“2.6.2.1”項(xiàng)色譜條件下于0、6、12、16、20 h進(jìn)樣，測得朝藿定C 峰面積RSD 為0.7%，表明供試品溶液在20 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（S1）6 份，精密稱定，按“2.6.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.6.2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，測得朝藿定C 含有量RSD 為1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取朝藿定C 對(duì)照品23.80 mg，置于200 mL 量瓶中，加稀乙醇適量，超聲溶解，放冷，加稀乙醇至刻度，作為回收對(duì)照品溶液（0.110 2 mg／mL）。取6 份樣品（S1），每份約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入回收對(duì)照品溶液20 mL，按“2.6.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.6.2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表6。

表6 朝藿定C 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of recovery tests for epimedin C

2.6.2.9 耐用性試驗(yàn) 取“2.6.2.7”項(xiàng)下供試品溶液、“2.6.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.6.2.1”項(xiàng)下方法對(duì)不同色譜儀、色譜柱、檢測波長、溫度等條件進(jìn)行考察，測得RSD 均小于2.4%，表明該方法耐用性良好。

2.6.2.10 樣品含有量測定 取15 批樣品，按“2.6.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取“2.6.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.6.2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，計(jì)算含有量（以干燥品計(jì)），結(jié)果見表5。8個(gè)品種15 批樣品中朝藿定C 含有量為0.96%～5.95%，參照2015 年版《中國藥典》 一部巫山淫羊藿含有量測定項(xiàng)下規(guī)定限度，建議將含有量限度暫定為按干燥品計(jì)算，含朝藿定C（C39H50O19）不得少于1.0%。

2.6.2.11 朝藿定C、淫羊藿苷含有量比較 不同品種淫羊藿根、葉中黃酮類成分含有量的差異很大；不同部位中淫羊藿苷含有量依次為葉高于根高于莖，但大部分品種根、葉中朝藿定C 含有量都較高［10-11］。取“2.6.2.3”項(xiàng)下供試品溶液，按2015 年版《中國藥典》 一部淫羊藿項(xiàng)下方法測定淫羊藿根、朝藿定C 含有量，結(jié)果見表7，可知后者明顯更高。

表7 各樣品中朝藿定C、淫羊藿苷含有量比較（%）Tab.7 Comparison of contents of epmedin C and icariin in various samples（%）

3 討論

黔嶺淫羊藿、水城淫羊藿是貴州省獨(dú)有品種，前者收載于2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》 黔淫羊藿項(xiàng)下（地上部分），是當(dāng)?shù)刂髁髌贩N之一，蘊(yùn)藏量較大［12-13］。因此，建議在淫羊藿根的來源中增加黔嶺淫羊藿、水城淫羊藿根，以擴(kuò)大貴州省該藥材覆蓋范圍。

研究表明，淫羊藿主要活性成分為黃酮類，其中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷含有量較高，5 種成分總量約占淫羊藿總黃酮的10%～20%［10］。2015 年版《中國藥典》 一部淫羊藿（葉）以淫羊藿苷為指標(biāo)成分（不得少于0.5%），巫山淫羊藿（葉）以朝霍定C 為指標(biāo)成分測定含有量（不得少于1.0%）。本實(shí)驗(yàn)檢測了8 批淫羊藿根中淫羊藿苷、朝霍定C 含有量，發(fā)現(xiàn)前者較低，均未達(dá)到《中國藥典》 規(guī)定限度；后者較高，最低也有0.86%，與巫山淫羊藿含有量測定項(xiàng)下朝藿定C 規(guī)定限度相近，故以其為淫羊藿根的指標(biāo)成分。

淫羊藿在加熱炮制過程中，與朝藿定A、B、C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ母核相同的其他黃酮苷類成分可脫去糖基，轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ［11］，導(dǎo)致朝藿定C 含有量下降，淫羊藿苷含有量升高。因此，建議淫羊藿根藥材洗凈后曬干。

將淫羊藿苷作為淫羊藿的指標(biāo)成分時(shí)，其含有量在某些品種中并不能達(dá)到《中國藥典》 標(biāo)準(zhǔn)，易造成藥材資源大量浪費(fèi)［14-16］。因此，同時(shí)測定淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 的總含有量作為淫羊藿質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)較為合理，但其檢驗(yàn)成本較高，有待進(jìn)一步尋求更為理想的方法。