巴戟天不同部位中6 種寡糖分布規(guī)律

楊 麗，孫 恬，馮 沖，蔡苗苗，丁 平?

［1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.天方?。ㄖ袊?藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510623］

巴戟天Morinda officinalisHow 為茜草科藤本植物，是我國嶺南地區(qū)（尤其是廣東、廣西）最受歡迎的中藥材之一，主要用于骨骼保護、男科和婦科保健方面［1］，含有多種成分，其中以蒽醌、環(huán)烯醚萜苷類等次生代謝產(chǎn)物和糖類較多［2-3］。菊淀粉型寡糖作為一類生理活性物質(zhì)，具有促進精子生成、抗抑郁、調(diào)節(jié)激素水平等作用，在疾病預(yù)防、治療、營養(yǎng)保健等方面有著極大的應(yīng)用潛力［4-6］。在2015 年版《中國藥典》 一部中，以巴戟天所含耐斯糖含有量來衡量藥材質(zhì)量，規(guī)定干品中其含有量不得少于2.0%［7］。

中藥材的外觀性狀特性是評價其質(zhì)量的重要指標，市場上常根據(jù)藥材的直徑、長度等性狀將其劃分成不同的等級規(guī)格，如黃芩、天麻、黃芪等［8-9］，巴戟天的等級亦是根據(jù)直徑大小來劃分，直徑越大，等級越高，價格就越高。但現(xiàn)在巴戟天野生資源匱乏，市場需求量較大，存在部分種植戶使用激素或過度施肥來提高產(chǎn)量，縮短種植年限，導(dǎo)致其根條粗壯、肉質(zhì)肥厚而有效成分含有量卻很低，藥材質(zhì)量明顯下降，對臨床用藥安全造成了一定的隱患。因此，僅根據(jù)直徑劃分等級能否真正區(qū)分巴戟天藥材質(zhì)量、這種劃分方式是否科學(xué)還有待進一步研究，另外，藥材其他部位是否有寡糖分布尚未有文獻報道。所以，本研究通過探索巴戟天根系及其他部位寡糖類成分的分布規(guī)律，以期為建立科學(xué)合理的藥材商品規(guī)格和資源的有效利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Primaide 高效液相色譜儀（日立高新技術(shù)公司）；ELSD-UM5800 蒸發(fā)光散射檢測器（上海通微有限公司）；XR205 SM-DR 電子分析天平（0.01 mg，瑞士Precisa 公司）；電子分析天平（0.1 mg，德國Sartorius 公司）；CQ-200 超聲波清洗器（上海音波聲電科技公司）；LD4-2A 低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。

1.2 試劑與藥物 色譜純乙腈（美國ACS 公司）；色譜純?nèi)野罚ㄌ旖蚩泼軞W化學(xué)試劑有限公司）；分析純無水乙醇（天津市百世化工有限公司）；水為去離子水。

果糖（批號SS0905GA14）、葡萄糖（批號SA0418GA14）、蔗糖（批號S02S6G1）蔗果三糖（批號AWG0714）、耐斯糖（批號Z17A9H59088）、蔗果五糖（批號S09A8D41431）對照品均購自上海源葉生物科技有限公司（純度均大于98%）。

在廣東德慶縣高良鎮(zhèn)巴戟天種植基地收集同一年限巴戟天（均為4 年生），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)丁平研究員鑒定為茜草科植物巴戟天Morinda officinalisHow 全株，分為主根、側(cè)根、須根、木心、根莖、莖、葉7 個部位。為了解巴戟天根中耐斯糖等寡糖的分布規(guī)律，再將主根和側(cè)根分為根頭、根中、根尖3 個部分，并測量每個分段的上下橫截面直徑，取平均值。共取10 株樣品，除去木心，打碎（過2 號篩），測定寡糖類成分、水分含有量（按干燥品計算）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters XBridgeTMAmide 色譜柱（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；流動相0.2%三乙胺乙腈（A）-0.2%三乙胺水（B），梯度洗脫，程序見表1；柱溫35 ℃；進樣量20 μL；ELSD 漂移管溫度75 ℃；氮氣體積流量2.5 L／min［10］?？瞻兹芤?、對照品及供試品色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖對照品適量，60%乙腈溶解后定容至10 mL，制成質(zhì)量濃度分別為0.750、1.061、1.210、0.832、1.280、1.658 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 稱取1.0 g 樣品，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，靜置30 min，超聲處理（250 W、80 kHz）20 min，50%乙醇補足減失的質(zhì)量，3 000 r／min 離心10 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 吸取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，50% 乙醇定容至1 mL，制成不同質(zhì)量濃度的溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以進樣量的對數(shù)為橫坐標（X），峰面積積分值的對數(shù)為縱坐標（Y）進行回歸。結(jié)果見表2。

2.3.2 精密度試驗 吸取同一供試品溶液（主根根頭），在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6 次，測得果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖含有量RSD 分別為1.91%、4.73%、1.57%、2.86%、2.15%、1.94%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 重復(fù)性試驗 取同一批巴戟天（主根根頭）6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖含有量RSD 分別為 2.20%、2.68%、4.12%、3.26%、2.10%、2.01%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取巴戟天（主根根頭），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下于0、2.5、5、7.5、10、12.5、24、48、72 h 各進樣20 μL，測得果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖含有量RSD 分別為1.77%、3.51%、3.51%、4.72%、5.09%、4.16%，表明供試品溶液在72 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取含有量已知的巴戟天（主根根頭）9 份，每份0.5 g，精密稱定，精密加入一定量對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，計算回收率。結(jié)果，果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖平均加樣回收率分別為97.28%、97.90%、101.00%、101.69%、99.79%、101.29%，RSD 分別為2.25%、2.08%、2.01%、1.92%、2.36%、1.78%。

2.4 樣品含有量測定 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共測定10 株巴戟天主根、側(cè)根、須根等7 個部位中耐斯糖等6 種寡糖含有量，每株至少對3 條主根和3 條側(cè)根進行分段測定，結(jié)果見表3。巴戟天主根和側(cè)根中均含耐斯糖等6 種寡糖類成分，主根中均大于側(cè)根中；10 株巴戟天主根和側(cè)根的根頭、根中、根尖中耐斯糖平均含有量分別為45.76、59.31、65.04 mg／g，直徑分別為0.92、0.77、0.67 cm。為考察根中6 種寡糖含有量與直徑是否具有相關(guān)性，利用SPSS 20.0 軟件對兩者進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表4，表明耐斯糖、蔗果三糖、蔗果五糖含有量與對應(yīng)分段樣品的直徑呈負相關(guān)。

表3 各成分含有量測定結(jié)果（±s，mg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（±s，mg／g）

表3 各成分含有量測定結(jié)果（±s，mg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（±s，mg／g）

注：—為未檢測出。

表4 各成分含有量及直徑之間相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficients between various constituents’ contents and diameters

巴戟天其他部位須根和木心中所含寡糖類成分與主、側(cè)根一致，其中耐斯糖含有量分別為32.33、20.35 mg／g；根莖、莖和葉中僅含有果糖、葡萄糖或蔗糖，不含耐斯糖等4 鏈以上的寡糖。

3 討論

本實驗考察了影響巴戟天寡糖類成分提取效率的幾個因素，如提取方法（水浴、回流、超聲）、提取溶劑（甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇）和提取時間（20、30、40 min）。結(jié)果，超聲提取率最高，故選擇超聲提取；50%甲醇、50%乙醇提取率均較高，但后者提取的寡糖成分色譜信息更豐富，分離度更好，同時甲醇毒性較大，因此選擇50%乙醇作為提取溶劑，提取時間以30 min 為宜。

本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，考察了甲醇-水、乙腈-水、三乙胺乙腈-三乙胺水對巴戟天寡糖的分離效果，發(fā)現(xiàn)采用甲醇-水為流動相時巴戟天寡糖分離效果并不理想；乙腈-水分離效果明顯改善，但基線漂移明顯，加入等比例三乙胺后能明顯改善，以2%～3%為最佳?？紤]到3%三乙胺pH 值較大，可能會影響氨基柱使用壽命，因此選擇在流動相中添加2%三乙胺。

巴戟天根（主、側(cè)）中寡糖類成分分布具有明顯的規(guī)律，從根頭到根中、根尖，蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖含有量逐漸增加，其中耐斯糖在根尖中高于根頭中約42%，在其他藥用植物中也具有類似規(guī)律［11-13］。結(jié)合相關(guān)報道［14］，推測可能是由根尖生長素含有量較高的因素造成，具體有待進一步研究。

巴戟天根中蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖含有量與其直徑呈負相關(guān)，與傳統(tǒng)的商品規(guī)格分級相矛盾［15］，課題組認為對該藥材進行規(guī)格劃分時，需將產(chǎn)地、生長年限、根直徑、寡糖成分分布規(guī)律等因素進行綜合考慮，基于前期研究［16-17］建議將4～5 年生巴戟天的根尖劃分為一等品，根中和根頭劃分為二等品或三等品。另外，其他部位須根和木心中所含寡糖類成分和主側(cè)根一致，其中耐斯糖含有量均較高，可考慮將兩者作為寡糖類成分提取的原料，有利于資源的有效利用。

本實驗首次對同一生長年限巴戟天不同部位中寡糖類成分的分布規(guī)律進行研究，以期為藥材等級標準的建立提供依據(jù)，同時也可為該資源的合理利用提供參考。