中成藥和保健食品中非法添加38 種激素的快速篩查

郭常川，邢 晟，許嘉平，周黎明，石 峰?，曾 蘇

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101；2.山東省藥品審評認(rèn)證中心，山東 濟(jì)南 250014；3.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058）

糖皮質(zhì)激素是一類母核為環(huán)戊烷駢多氫菲結(jié)構(gòu)的甾體激素，具有抗炎、免疫抑制、抗過敏、抗休克等作用，用于治療支氣管哮喘、急性蕁麻疹、敗血癥等疾?。?］，但具有許多不良反應(yīng)，包括骨質(zhì)疏松癥、減弱機(jī)抵抗力、代謝紊亂等［2-3］；性激素具有促進(jìn)毛發(fā)生長、增加皮膚彈性、防止皮膚老化等作用。一些不法分子為達(dá)到其宣稱的療效，在中成藥和保健食品中非法添加上述激素，如醋酸潑尼松、甲睪酮、雌二醇等，長期服用易導(dǎo)致多種不良反應(yīng)及癌癥的發(fā)生［4］。

激素類藥物的檢測缺乏相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，目前已報道的分析方法主要包括TLC［5］、HPLC［6-9］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）［10-16］。其中，HPLC 法難以滿足同時測定幾十種激素的要求，且分析速度慢，靈敏度低；LC-MS 法則主要采用液相色譜串聯(lián)低分辨質(zhì)譜（如三重四極桿［11］等），但其分辨率低，確證手段少，鑒定能力弱，可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果的發(fā)生；Orbitrap 高分辨率質(zhì)譜可大幅提高篩查定性能力，結(jié)果更加真實(shí)可靠，同時具有堪比三重四極桿的定量性能。

本研究旨在開發(fā)一種快速、簡便的超高效液相色譜-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-Orbitrap HRMS）法，同時構(gòu)建TraceFinder 篩查數(shù)據(jù)庫和自動篩查方法，用于中成藥和保健食品中非法添加38 種激素的快速篩查、鑒定和定量。

1 材料

Thermo Q Exactive PlusTM超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，包括Ultimate 3000 液相泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、Orbitrap 高分辨質(zhì)譜、XCalibur 4.0（美國Thermo 公司）；XS205 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；3K15 高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma 公司）；Vortex3 漩渦混勻器（德國IKA 公司）。

38 種激素類對照品均購自中國食品藥品檢定研究院（純度＞96.0%）。HPLC 級甲醇（純度99.9%）、乙腈（純度99.9%）、超純水均購自美國Fisher 公司；HPLC 級乙酸銨（純度97%）購自美國ACS 恩科化學(xué)公司。36 批中成藥和22 批保健食品來自山東省食品藥品監(jiān)督管理局或山東省各市、縣食品藥品監(jiān)督管理局抽樣。以未檢出以上激素的樣品2～3、6～8 混合物作為陰性樣品基質(zhì)。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取激素類對照品10.00 mg 于50 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻（200.0 μg／mL），50% 甲醇稀釋為2.0 μg／mL 中間溶液，50% 甲醇逐步稀釋為5.0、10、50、100、200、500、1 000 ng／mL，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取供試品約0.5 g，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲提取15 min，放冷至室溫，提取溶劑定容至刻度，上清液過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。若測得成分含有量超過定量限，則以50%甲醇稀釋。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

2.2.1 色譜條件 Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm× 2.1 mm，3 μm）；流動相10 mmol／L 乙酸銨（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10%B；0.5～14.0 min，10%～90% B；14.0～16.0 min，90% B；16.0～16.1 min，90%～10% B；16.1～18.0 min，10%B）；體積流量400 μL／min；柱溫45 ℃；自動進(jìn)樣器溫度20 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 Q ExactiveTM質(zhì)譜系統(tǒng)配有HESI源，采用正負(fù)離子同時掃描模式，噴霧電壓為3.0 kV（正離子模式）或2.5 kV（負(fù)離子模式），毛細(xì)管溫度和噴霧溫度分別為350、250 ℃。鞘氣和輔助氣分別設(shè)為40、15 arb，S-lens RF 電壓為50 V。采用正負(fù)離子同時掃描，F(xiàn)ull MS／dd-MS2模式，F(xiàn)ull MS（一級全掃描）范圍為m／z100～1 000，自動增益控制AGC、最大注入時間IT 分別設(shè)為1.0×106、100 ms；dd-MS2（數(shù)據(jù)依賴的二級掃描）AGC設(shè)為2.0×106，最大IT 設(shè)為50 ms，分離窗口設(shè)為1.0m／z，強(qiáng)度閾值設(shè)為4.0×106，同位素排除設(shè)為“on”，動態(tài)排除設(shè)為10.0 s。各化合物步進(jìn)歸一化碰撞能量（NCE）設(shè)為20、40、60 V。

2.3 軟件 本研究使用TraceFinder 3.3 軟件進(jìn)行定性篩查，MassFrontier 7.0 軟件進(jìn)行質(zhì)譜碎片離子裂解機(jī)理研究，XCalibur 4.0 軟件進(jìn)行定量分析，Excel 2007 軟件進(jìn)行數(shù)值計算。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法建立 由于需要提取得到盡可能多的可疑化學(xué)成分，故本研究選擇甲醇作為提取溶劑，它對38 種激素均有較高的提取效率，上清液過濾后可直接進(jìn)樣，從而簡化樣品前處理。掃描方式選擇Full MS／dd-MS2模式，此模式包含一次一級全掃描和一次數(shù)據(jù)依賴的二級掃描，一級質(zhì)譜全掃描分辨率采用70 000 FWHM，保證得到高分辨質(zhì)譜準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)；數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描分辨率采用17 500 FWHM，保證高分辨掃描的同時加快掃描速度。本研究基于儀器獲取的化合物保留時間、分子離子質(zhì)量數(shù)、碎片離子質(zhì)量數(shù)、同位素分布等信息，采用一級質(zhì)譜分子離子峰準(zhǔn)確質(zhì)量作為定量離子進(jìn)行定量分析。

取10 ng／mL 對照品溶液進(jìn)樣分析，記錄提取離子色譜圖，見圖1，38 種激素可在18 min 內(nèi)完成分離和洗脫，峰形對稱性好、靈敏度高、分析速度快。2 對激素同分異構(gòu)體（醋酸可的松和醋酸潑尼松龍，m／z均為403.211 5；醋酸地塞米松和曲安奈德，m／z均為435.217 7）雖然質(zhì)荷比完全相同，但在色譜上可以基線分離，并且具有不同的二級質(zhì)譜，故該方法對同分異構(gòu)體也有良好的分析能力。

3.2 專屬性試驗(yàn) 取陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備空白基質(zhì)溶液，進(jìn)樣分析。在提取離子色譜圖中，各化合物保留時間處沒有干擾峰出現(xiàn)或很小（低于檢出限的10%），對定性和定量分析均沒有影響，表明方法專屬性強(qiáng)。

3.3 檢出限 逐級稀釋對照品溶液并進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計算信噪比，以信噪比S／N≥3 時對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限。結(jié)果，38 種激素的檢出限在0.2～1.0 ng／mL 范圍之間。

圖1 38 種激素提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of thirty-eight hormones

3.4 線性關(guān)系考察 取系列對照品溶液進(jìn)樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸。結(jié)果，38 種激素在5.0～1 000 ng／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.998）。

3.5 加樣回收率、準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 精密移取對照品貯備液5 μL，精密稱取陰性供試品0.5 g，置于10 mL 量瓶中，先加入適量甲醇溶解，超聲提取15 min，放冷至室溫，再繼續(xù)加入甲醇并定容至刻度，上清液過濾后得供試品溶液（質(zhì)量濃度約為100 ng／mL），平行6 份，在“2.2.1”項條件下進(jìn)樣，計算回收率，結(jié)果見表1。

3.6 基質(zhì)效應(yīng)與穩(wěn)定性 制備100 ng／mL 空白基質(zhì)加標(biāo)溶液、對照品溶液，分別進(jìn)樣，計算兩者響應(yīng)值比例，即為基質(zhì)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)38 種激素的基質(zhì)效應(yīng)均在92.7%～112.4% 之間，表明空白基質(zhì)對其響應(yīng)影響很小。考察了100 ng／mL對照品溶液在自動進(jìn)樣器中放置1、2、4、6、8、12、24 h的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)38 種激素穩(wěn)定性均在96.2%～104.5%之間，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7 開發(fā)與應(yīng)用 采用TraceFinder 3.3 軟件進(jìn)行快速自動篩查，建立38 種激素數(shù)據(jù)庫，見表2。

本實(shí)驗(yàn)分子離子準(zhǔn)確質(zhì)量和碎片離子準(zhǔn)確質(zhì)量偏差閾值均設(shè)為1.0×10-6，保留時間窗口設(shè)為15 s，提取離子色譜峰面積閾值設(shè)為1.0×108，碎片離子強(qiáng)度閾值設(shè)為1.0×104。TraceFinder 軟件內(nèi)置同位素分布評分系統(tǒng)，會根據(jù)單同位素離子豐度比、質(zhì)量偏差、每種同位素離子的權(quán)重進(jìn)行評分，分?jǐn)?shù)越高則匹配度越大，并且評分過程實(shí)現(xiàn)了自動化和智能化，可以快速識別和鑒定大量化合物，本實(shí)驗(yàn)評分閾值設(shè)為80 分，質(zhì)量偏差閾值設(shè)為1.0×10-5，同位素離子強(qiáng)度偏差閾值設(shè)為20%。

最后，將UPLC-Orbitrap HRMS 高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀采集的所有樣品原始數(shù)據(jù)（raw 格式）直接導(dǎo)入TraceFinder 軟件，選取建立的篩查數(shù)據(jù)庫和篩查方法進(jìn)行自動篩查，軟件會自動把液質(zhì)聯(lián)用儀采集的樣品信息（分子離子準(zhǔn)確質(zhì)量、保留時間、碎片離子準(zhǔn)確質(zhì)量、同位素分布）與預(yù)先設(shè)定的篩查數(shù)據(jù)庫、篩查方法、接受標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行自動比對，如果某個離子上述信息均符合篩查標(biāo)準(zhǔn)，則判定為陽性。樣品1 的［M+H］+403.211 2 離子實(shí)測和理論保留時間偏差（0.02 min，即1.2 s）、分子離子準(zhǔn)確質(zhì)量與理論值偏差（-0.713 9×10-6）、碎片離子準(zhǔn)確質(zhì)量與理論值偏差（均小于0.6 ×10-6）均在篩查方法設(shè)定的接受標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)，同位素分布匹配的評分為“100”；MZ（質(zhì)荷比）、RT（保留時間）、IP（同位素分布）、FI（碎片離子）均為綠燈，表示符合篩查接受標(biāo)準(zhǔn)；Flag 標(biāo)記也為綠燈，表明檢出了Prednisolone acetate（醋酸潑尼松龍）。圖2 給出了代表性陽性樣品（樣品1）的提取離子色譜圖，圖3 給出了代表性陽性樣品（樣品1）的一級質(zhì)譜圖、同位素分布及二級質(zhì)譜圖。

表1 38 種激素線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of thirty-eight hormones

3.8 結(jié)果 在13 批中成藥或保健食品中檢出了非法添加激素，總陽性率為22.4%，涉及醋酸潑尼松龍、甲潑尼龍、醋酸曲安奈德、醋酸潑尼松，含有量為0.185～17.9 mg／g。由此表明，中成藥和保健食品中激素類藥物非法添加情況十分嚴(yán)峻，食品藥品監(jiān)管部門應(yīng)強(qiáng)化對相關(guān)市場的監(jiān)督檢查，以保障人民群眾生命安全。

圖2 代表性陽性樣品提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of the representative positive sample

表2 38 種激素Obitrap HRMS 數(shù)據(jù)庫Tab.2 Obitrap HRMS database of thirty-eight hormones

4 結(jié)論

本研究建立了一種快速檢測中成藥和保健食品中非法添加激素的高分辨液質(zhì)聯(lián)用法，可在18 min內(nèi)完成。同時，利用TraceFinder 軟件構(gòu)建了Orbitrap 高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，建立了篩查方法，將液質(zhì)聯(lián)用儀采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入TraceFinde 軟件，可進(jìn)行快速、自動篩查分析，并可使用XCalibur 軟件進(jìn)行定量。與已報道的檢測手段相比，該方法選擇性好，快速簡便，篩查結(jié)果準(zhǔn)確可靠，自動化程度高，可滿足同時定性和定量的需求，適用于中成藥及保健食品中激素非法添加的快速檢測，并為相關(guān)監(jiān)管提供了技術(shù)支持。

圖3 代表性陽性樣品的一級質(zhì)譜圖、同位素分布及二級質(zhì)譜圖Fig.3 Full scan mass spectrum，isotope pattern and secondary mass spectrum of representative positive sample