枇杷葉紫珠化學成分及其細胞毒活性和抗炎活性

吳中含，陳靖靖，徐 凡，王紅剛

（廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

枇杷葉紫珠Callicarpa kochiana為馬鞭草科紫珠屬植物，廣泛分布在我國廣東、福建、臺灣、江西、浙江、湖南、河南南部等地區(qū)［1］，以其干燥莖葉入藥，功效散瘀消腫、止血鎮(zhèn)痛、祛痰止咳，嶺南地區(qū)民間常用來治療咳血、吐血、鼻出血、創(chuàng)傷出血等出血癥［2］。目前，從枇杷葉紫珠中分離得到的化合物主要為黃酮類、萜類和苯乙醇苷類，藥理活性主要集中在抗氧化、改善記憶功能障礙等方面［3-6］，但整體研究較少，不夠深入。

現(xiàn)代研究表明，多數(shù)紫珠屬植物具有止血、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等藥理作用［7-11］。為進一步闡明枇杷葉紫珠的化學成分，本研究從其丙酮提取物中分離得到2 個黃酮類、3 個二萜類化合物，并采用CCK8 法、Griess 法和ELISA 法對14α-hydroxy-7，15-isopimaradien-18-oic acid（4）和（16R）-16，17-dihydroxyphyllolladan-3-one（5）進行7 種癌細胞的細胞毒活性篩選，以及RAW264.7 細胞的抗炎活性評價。

1 材料

高壓滅菌鍋、二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機（廣州飛迪生物科技有限公司）；Bio Tek 酶標儀、Eon微孔板分光光度計（美國BioTek 公司）；倒置生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；細胞培養(yǎng)搖床（天津市歐諾儀器儀表有限公司）。CCK8 試劑盒（日本同仁化學研究所）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、RPMI1640 培養(yǎng)基（美國賽默飛世爾科技公司）。鼠源白細胞介素10 試劑盒（IL-10）、鼠源腫瘤壞死因子（MCP-1）試劑盒、鼠源單核細胞趨化蛋白（TNF-α）試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）。人肺癌細胞A549（上海中科院細胞庫）；人肺癌細胞H1299（上海富衡生物科技有限公司）；人宮頸癌細胞Hela（ATCC 細胞庫）；人紅細胞白血病細胞K562（ATCC 細胞庫）；人乳腺癌細胞MCF-7（ATCC 細胞庫）；人肝癌細胞Hepg2（廣州賽庫公司CC0101）；人前列腺癌細胞PC3（ATCC細胞庫）；小鼠巨噬細胞RAW264.7（ATCC）。所用試劑均為分析純。

枇杷葉紫珠于2017 年10 月15 日采自廣東省普寧市，經(jīng)華南植物園葉華谷教授鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物枇杷葉紫珠Callicarpa kochiana，藥材憑證標本保存于廣東藥科大學中藥標本館。

2 提取與分離

枇杷葉紫珠15 kg 粉碎為粗粉后，用90% 丙酮-水冷浸提取4 次，每次3 d，回收溶劑，濃縮得流浸膏1 921 g。將浸膏加水分散后，依次以相同體積的石油醚、乙酸乙酯萃取4 次。濃縮萃取液后得石油醚部位流浸膏22 g、乙酸乙酯部位流浸膏932 g、水部位流浸膏48 g。

石油醚部位流浸膏（22 g）經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯（100∶1～6∶1）梯度洗脫，得6個組分Si.A～Si.F，Si.E 經(jīng)凝膠柱色譜，100%甲醇洗脫，得6 個組分Si.E.1～Si.E.7。Si.E.3 經(jīng)凝膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得化合物1（5 mg）；Si.E.4 經(jīng)凝膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，半制備HPLC 純化 ［乙腈-水（80∶20）］，得化合物2（4 mg）。

乙酸乙酯部位浸膏（932 g）經(jīng)MCI 柱色譜，甲醇-水（60%～100%）梯度洗脫，得5 個組分Fr.A～Fr.E。Fr.B（69.37 g）經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯（200∶1～6∶1）梯度洗脫，得5 個組分Fr.B.1～Fr.B.5。Fr.B.5 經(jīng)硅膠柱色譜反復洗脫和半制備HPLC 純化［甲醇-水（80∶20）］，得到化合物3（12 mg）、5（43 mg）；Fr.C（106 g）經(jīng)硅膠柱色譜、ODS 柱色譜反復洗脫，再經(jīng)半制備HPLC 純化［甲醇-水（80∶20）］，得化合物4（155 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，易溶于甲醇，分子式C19H18O7。1H-NMR（500 Hz，CDCl3）δ：7.74（1H，dd，J＝1.93，8.62 Hz，H-6′），7.69（1H，d，J＝2.10 Hz，H-2′），7.00（1H，d，J＝8.54 Hz，H-5′），6.45（1H，d，J＝2.21 Hz，H-8），6.37（1H，d，J＝2.24 Hz，H-6），3.98（3H，s，-OCH3），3.97（3H，s，-OCH3），3.88（3H，s，-OCH3），3.87（3H，s，-OCH3）；13C-NMR（125 Hz，CDCl3）δ：156.0（C-2），139.2（C-3），178.9（C-4），106.3（C-4a），156.9（C-5），98.0（C-6），165.6（C-7），92.4（C-8），162.2（C-8a），123.1（C-1′），111.5（C-2′），149.0（C-3′），151.5（C-4′），111.0（C-5′），122.3（C-6′），60.4（-OCH3），56.2（-OCH3），56.2（-OCH3），56.0（-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］基本一致，故鑒定為3，7，3′，4′-tetramethyl-quercetin。

化合物2：黃色粉末，易溶于甲醇，分子式C18H16O7。1H-NMR（500 Hz，DMSO）δ：7.66（1H，d，J＝1.92 Hz，H-2′），7.62（1H，dd，J＝2.05，8.46 Hz，H-6′），6.94（1H，d，J＝8.51 Hz，H-5′），6.77（1H，d，J＝1.29 Hz，H-8），6.34（1H，d，J＝1.55 Hz，H-6），3.80，3.85，3.86（3H，s，3′-，7-，3-OCH3）；13C-NMR（125 Hz，DMSO）δ：155.9（C-2），137.8（C-3），177.9（C-4），156.3（C-5），97.8（C-6），165.1（C-7），92.4（C-8），160.9（C-9），105.2（C-10），120.0（C-1′），112.0（C-2′），147.7（C-3′），150.8（C-4′），115.8（C-5′），122.5（C-6′），59.7（3-OCH3），56.1（7-OCH3），55.8（3′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［13-14］基本一致，故鑒定為pachypodol。

化合物3：白色結(jié)晶，易溶于氯仿，分子式C20H30O3。1H-NMR（500 Hz，CDCl3）δ：5.87（1H，dd，J＝17.7，10.8 Hz，H-15），5.65（1H，d，J＝4.9 Hz，H-7），5.11（1H，dd，J＝10.9，1.0 Hz，H-16b），5.07（1H，dd，J＝17.9，1.0 Hz，H-16a），3.60（1H，s-like，H-14β），1.23（3H，s，H-19），0.87（3H，s，H-17）；13C-NMR（125 Hz，CDCl3）：δ：38.8（C-1），18.1（C-2），37.1（C-3），46.2（C-4），44.7（C-5），25.3（C-6），127.1（C-7），137.5（C-8），47.1（C-9），34.8（C-10），19.3（C-11），27.5（C-12），41.0（C-13），79.7（C-14），146.6（C-15），113.4（C-16），22.1（C-17），181.5（C-18），17.4（C-19），15.2（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻［15-16］基本一致，故鑒定為14α-hydroxyisopima ric acid。

化合物4：白色結(jié)晶，易溶于氯仿，分子式C20H30O3。1H-NMR（500 Hz，CDCl3）δ：5.87（1H，m，H-15），5.67（2H，m，H-7），5.13（1H，d，J＝10.86 Hz，H-16b），5.09（1H，d，J＝17.71 Hz，H-16a），3.65（1H，s，H-14β），1.24（3H，s，H-19），0.87（3H，s，H-17），0.86（（3H，s，H-20）；13C-NMR（125 Hz，CDCl3）δ：38.8（C-1），18.1（C-2），36.7（C-3），46.2（C-4），44.6（C-5），25.3（C-6），127.3（C-7），137.2（C-8），47.1（C-9），34.8（C-10），19.3（C-11），27.5（C-12），41.0（C-13），79.6（C-14），146.5（C-15），113.7（C-16），22.1（C-17），182.9（C-18），17.3（C-19），15.2（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻［17］基本一致，故鑒定為14α-hydroxy-7，15-isopimaradien-18-oic acid。

化合物5：白色粉末，易溶于氯仿，分子式C20H32O3。1H-NMR（500 Hz，CDCl3）δ：3.67（1H，d，J＝10.9 Hz，H-17a），3.53（1H，d，J＝10.9 Hz，H-17b），2.40（1H，ddd，J＝15.9，10.9，7.3 Hz，H-2a），2.27（1H，ddd，J＝15.8，7.0，4.0 Hz，H-2b），1.98（1H，ddd，J＝14.4，8.1，2.0 Hz，H-14a），1.96（1H，dd，J＝14.5，1.7 Hz，H-15a），1.77（1H，ddd，J＝13.25，7.27，4.02 Hz，H-1a），1.60（1H，m，H-7），1.59（1H，m，H-12a），1.46（1H，m，H-11b），1.38（1H，m，H-6b），1.37（1H，d，J＝4.72 Hz，H-12b），1.33（1H，m，H-1b），1.29（1H，m，H-6a），1.27（1H，m，H-5），1.21（1H，m，H-11a），1.15（1H，d，J＝14.7 Hz，H-15b），1.04（1H，dd，J＝12.3，4.7 Hz，H-9），1.00（1H，d，J＝11.39 Hz，H-14b），0.97（3H，s，H-18），0.92（3H，s，H-19），0.88（3H，s，H-20）；13C-NMR（125 Hz，CDCl3）δ：38.3（C-1），34.1（C-2），217.8（C-3），47.4（C-4），55.5（C-5），21.4（C-6），40.6（C-7），43.6（C-8），55.9（C-9），37.3（C-10），19.8（C-11），26.8（C-12），44.1（C-13），48.2（C-14），44.7（C-15），84.6（C-16），65.8（C-17），26.9（C-18），21.7（C-19），14.9（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻［18］基本一致，故鑒定為（16R）-16，17-dihydroxyphyllolladan-3-one。

4 生物活性

4.1 細胞毒活性

4.1.1 細胞復蘇與培養(yǎng) 將A549、H1299、Hela、K562、MCF-7、Hepg2、PC3 細胞株分別從-80 ℃冰箱中取出，37 ℃恒溫水浴中快速溶解，然后將凍存管中的細胞懸液轉(zhuǎn)移至已加入10 mL 完全培養(yǎng)基的離心管中，800 r／min 低速離心5 min，棄去上清液，細胞沉淀加入適量完全培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻，最后轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，放置在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。其中A549、H1299、Hela、K562 細胞株完全培養(yǎng)基由90% RPMI1640 培養(yǎng)基+10% 胎牛血清混合而成，MCF-7、Hepg2、PC3 細胞株完全培養(yǎng)基由90%DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基+10%胎牛血清混合而成。

4.1.2 CCK8 法測定細胞毒性 將對數(shù)生長期細胞接種于96 孔板中，調(diào)整細胞濃度為7×104／mL，每孔100 μL，96 孔板邊緣加100 μL PBS，預培養(yǎng)20 h 后分組處理為①正常對照組，細胞不做任何處理，常規(guī)培養(yǎng)；②實驗組，化合物4～5 的200、250、300、350、400 μmol／L 藥液；③陽性對照組，200 μmol／L 順鉑藥液。將加入藥物的細胞分別培養(yǎng)24、48 h 后，每孔加入10 μL CCK8 溶液，放置在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，終止培養(yǎng)，放在細胞培養(yǎng)搖床上，在100 r／min、37 ℃下振搖6 min，調(diào)整波長為450 nm，溫度為37 ℃，檢測吸光度，計算抑制率。設置5 個復孔，每個重復3 次。

4.2 抗炎活性

4.2.1 細胞復蘇與培養(yǎng) 按“4.1.1”項下方法進行細胞復蘇與培養(yǎng)。

4.2.2 Griess 法測定化合物對細胞上清液中NO 釋放的影響 取對數(shù)生長期的細胞接種于96 孔板中，調(diào)整細胞濃度為1×105／mL，每孔100 μL，邊緣加100 μL PBS，預培養(yǎng)16 h 后分組處理為①正常對照組，細胞不做任何處理，常規(guī)培養(yǎng)；②LPS 組，只加 LPS；③實驗組，化合物 4 的 75、150、300 μmol／L藥液+LPS，化合物5 的37.5、75、150 μmol／L藥液+LPS；④陽性對照組，布洛芬+LPS。將加入藥物的細胞培養(yǎng)24 h后終止，分別取各給藥組細胞上清液50 μL于96 孔板中，加入50 μL A 液，靜置10 min，待其充分反應后再加入50 μL B液，避光，放在空氣搖床上，調(diào)整條件為37 ℃、100 r／min，振搖6 min，波長設置為546 nm，在酶標儀上測定吸光度，將其代入標準曲線中，計算NO 釋放量。設置5 個復孔，每個重復3 次。

4.2.3 ELISA 法測定化合物對細胞上清中TNF-α、IL-10、MCP-1 釋放量的影響 嚴格參照ELISA 試劑盒操作說明進行。

4.3 細胞毒活性 與空白組比較，當化合物4 濃度在250～400 μmol／L 時，對A549 細胞、H1299細胞作用24、48 h 均有抑制性，對Hepg2 細胞作用48 h 無抑制性，作用24 h 有一定的抑制性，對PC3 細胞作用48 h 有抑制性；各濃度下化合物4對Hela 細胞、K562 細胞均無抑制性，對PC3 細胞作用24 h 均有抑制性；當化合物4 濃度在300～400 μmol／L 時，對MCF-7 細胞作用24、48 h 均有抑制性；與空白組比較，各濃度下化合物5 作用24、48 h 對細胞均無抑制性。見圖1。

圖1 化合物4～5 對7 種細胞的抑制率Fig.1 Inhibition rates of compounds 4-5 on seven cells

4.4 抗炎活性 與模型組比較，當化合物4 濃度在75～300 μmol／L 時，均能夠減少NO、IL-10、MCP-1 的釋放量，且呈劑量依賴性；當化合物4 濃度為300 μmol／L 時，能夠減少TNF-α 的釋放量（P＜0.01）；各個濃度化合物5 均能減少TNF-α 的釋放量，但不呈劑量依賴性。見圖2。

圖2 化合物4～5 對NO、TNF-α、MCP-1、IL-10 釋放量的影響Fig.2 Effects of compounds 4-5 on releases of NO，TNF-α，MCP-1 and IL-10

5 討論

枇杷葉紫珠資源豐富，應用歷史悠久，本實驗首次從中分離得到化合物1～5，其中4 具有一定的細胞毒活性和抗炎活性，可為該植物后續(xù)藥理研究及抗炎、抗腫瘤藥物開發(fā)提供參考。