HPLC 法同時(shí)測(cè)定白術(shù)中4 種倍半萜

丁逸雪，徐繼校，吳 威，陸潔淼，董詩(shī)慧，余佳琰，秦路平，朱 波

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053）

白術(shù)系菊科蒼術(shù)屬植物白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，別名桴薊、于術(shù)、楊桴、吳術(shù)、片術(shù)等，為多年生草本植物，以根莖入藥，是浙江省著名道地藥材“浙八味”之一［1-2］。白術(shù)主要分布在浙江、安徽、河南等省，性溫，味辛、苦，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，臨床多用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、胎動(dòng)不安，被譽(yù)為健脾補(bǔ)氣第一要藥［3-4］。倍半萜類是白術(shù)的主要有效成分，包括白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明白術(shù)倍半萜類成分具有抗炎［5-6］、利尿［7］、抗衰老［8］、抗病毒［9］、抗腫瘤［10］、促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)［11］、提高機(jī)體免疫力［12］等作用。

白術(shù)現(xiàn)有報(bào)道多集中在藥理藥效［13］、提取工藝［14］、栽培技術(shù)［15］、化學(xué)成分［16］等方面，已有的含有量測(cè)定報(bào)道也多側(cè)重于方法學(xué)考察與不同批次飲片研究［17-18］。白術(shù)藥材原植物分布經(jīng)緯度跨度大，不同生境因子下藥材質(zhì)量參差不齊，加上白術(shù)現(xiàn)有栽培技術(shù)與栽培品系繁多混雜，導(dǎo)致偽品沖擊、以次充好等現(xiàn)象頻發(fā)，阻礙了白術(shù)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。不同產(chǎn)地來(lái)源的白術(shù)中次生代謝產(chǎn)物成分含有量存在差異，影響著中成藥的質(zhì)量和用藥安全［19］。因此，課題組以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮4 種倍半萜類成分為指標(biāo)性狀，收集全國(guó)白術(shù)主產(chǎn)區(qū)7 個(gè)產(chǎn)地白術(shù)種質(zhì)資源，建立HPLC 法對(duì)其進(jìn)行含有量測(cè)定，并分析白術(shù)生長(zhǎng)性狀、產(chǎn)地生境因子與倍半萜類成分含有量之間的相關(guān)性，以期為白術(shù)藥材質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材 2017 年10 月至2017 年11 月，收集浙江於潛、浙江慶元、安徽亳州、浙江東陽(yáng)、河南溫縣、浙江磐安、浙江新昌等7 個(gè)產(chǎn)地新鮮白術(shù)種質(zhì)資源，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室張巧艷教授鑒定為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖。信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 儀器與試劑 600-2998 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；FA2004 型電子分析天平（上海恒平精密電子儀器有限公司）；KQ-300DV 型超聲波（上海穎漢科技有限公司）；DXF-60D 型中藥打粉機(jī)（廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司）；DHG-9031A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信試驗(yàn)儀器有限公司）。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（B20054）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（B20055）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（B20056）、蒼術(shù)酮（B20129）對(duì)照品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。色譜純乙腈、甲醇均購(gòu)于北京京科瑞達(dá)科技有限公司；分析純甲醇購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生長(zhǎng)性狀測(cè)定 取健康白術(shù)塊莖，蒸餾水洗凈，陰干，用直尺測(cè)量塊莖縱徑、橫徑，計(jì)算縱橫徑比＝縱徑／橫徑，摘除塊莖須根，用電子天平稱定塊莖鮮重（n＝15）。

1.3.2 含有量測(cè)定

1.3.2.1 色譜條件 Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～30 min，50%～70% A；31～45 min，78%～95%A；46～50 min，50%A）；柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)220、276 nm；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

1.3.2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取適量白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮對(duì)照品，用甲醇制備成終質(zhì)量濃度分別為0.13、0.25、0.015、2.0 mg／mL 的對(duì)照品溶液。分別精密吸取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌啡芤?.20、0.40、0.60、0.80、1.0、2.0 mL，甲醇定容至5 mL；分別精密吸取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品溶液0.30、0.60、1.2、2.4、4.8、9.6 mL，甲醇定容至50 mL；分別精密吸取蒼術(shù)酮對(duì)照品溶液0.30、0.60、0.90、1.2、1.5、1.8 mL，甲醇定容至2 mL，吸取上述溶液適量，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，在“1.3.2.1”項(xiàng)色譜條件下依次進(jìn)樣，4 種成分檢測(cè)波長(zhǎng)分別為220、220、220、276 nm。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

1.3.2.3 供試品溶液制備 將洗凈后的塊莖切片，置于60 ℃烘箱中烘至恒定質(zhì)量，粉碎后過(guò)3 號(hào)篩。精密稱取白術(shù)塊莖樣品粉末0.5 g，20 mL 甲醇超聲提取30 min，抽濾，濾液用甲醇定容至25 mL 量瓶中，避光密閉保存。取適量樣品溶液，過(guò)0.45 μm微孔有機(jī)濾膜，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2.4 精密度試驗(yàn) 取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮對(duì)照品溶液適量，在“1.3.2.1”項(xiàng)色譜條件下依次進(jìn)樣6 次，測(cè)得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮峰面積RSD 分別為1.01%、0.83%、1.19%、0.92%，表明儀器精密度良好。

1.3.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取浙江慶元樣品，按“1.3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h 在“1.3.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮峰面積RSD 分別為0.89%、1.42%、1.48%、1.94%，表明供試品溶液在避光密閉保存24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取浙江慶元樣品3 份，按“1.3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.3.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮含有量RSD 分別為2.49%、2.03%、1.04%、1.96%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.3.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的浙江慶元樣品，精密稱定0.2 g，加入白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮對(duì)照品適量，按“1.3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.3.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 應(yīng)用DPS 9.5、SPSS 24.0軟件處理數(shù)據(jù)。方差分析采用單因素ANOVA 分析，聚類分析采用類平均法（UPGMA）［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)性狀比較 不同產(chǎn)地白術(shù)塊莖生長(zhǎng)性狀存在差異（P＜0.05 或P＜0.01）。供試白術(shù)塊莖平均縱徑、橫徑、鮮重分別為12.28 cm、6.41 cm、80.22 g，其中安徽亳州產(chǎn)者較大，縱徑、橫徑、鮮重分別為15.94 cm、8.04 cm、98.30 g；河南溫縣產(chǎn)者相對(duì)較小，縱徑、橫徑、鮮重指標(biāo)僅分別為9.03 cm、4.56 cm、64.98 g；浙江東陽(yáng)產(chǎn)者較為瘦長(zhǎng)，縱橫徑比為2.14，而浙江新昌產(chǎn)者較為寬胖，縱橫徑比僅為1.72。見(jiàn)表4。

表4 不同產(chǎn)地間白術(shù)生長(zhǎng)性狀、4 種倍半萜含有量比較（±s，n＝3、15）Tab.4 Comparison of growth traits and four sesquiterpenes contents in A.macrocephala from different growing areas（±s，n＝3，15）

表4 不同產(chǎn)地間白術(shù)生長(zhǎng)性狀、4 種倍半萜含有量比較（±s，n＝3、15）Tab.4 Comparison of growth traits and four sesquiterpenes contents in A.macrocephala from different growing areas（±s，n＝3，15）

注：n＝3，表示4 種成分含有量數(shù)據(jù)為3 次生物學(xué)重復(fù)；n＝15，表示縱徑、橫徑、縱橫徑比、鮮重?cái)?shù)據(jù)為15 次生物學(xué)重復(fù)。7 個(gè)產(chǎn)地組間比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

2.2 倍半萜類含有量比較 7 個(gè)產(chǎn)地間白術(shù)塊莖中4 種倍半萜含有量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮平均含有量分別為1.18、1.75、0.044 1、68.11 mg／g。其中，浙江於潛產(chǎn)者白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮含有量最高，浙江慶元產(chǎn)者白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ含有量最高，安徽亳州產(chǎn)者白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)酮含有量最低，河南溫縣產(chǎn)者白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含有量最低。

2.3 相關(guān)性分析 表5 顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)酮含有量與塊莖縱徑、橫徑、鮮重、緯度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中蒼術(shù)酮含有量與緯度負(fù)相關(guān)系數(shù)最高（-0.651 3），與塊莖縱橫徑比、經(jīng)度、海拔、降雨量、年平均溫度呈正相關(guān)關(guān)系，其中蒼術(shù)酮含有量與海拔正相關(guān)系數(shù)最高（0.820 2）；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含有量與縱橫徑比、緯度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與塊莖縱徑、橫徑、鮮重、經(jīng)度、海拔、降雨量、年平均溫度呈正相關(guān)關(guān)系，其中與塊莖縱徑正相關(guān)系數(shù)最高（0.530 3）。

表5 白術(shù)4 種倍半萜含有量與生長(zhǎng)性狀、生境因子相關(guān)性分析Tab.5 Correlation analysis of sesquiterpenes contents，growth traits and geographical factors

2.4 聚類分析 以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮含有量和生長(zhǎng)性狀為參考指標(biāo)，對(duì)7 個(gè)產(chǎn)地白術(shù)進(jìn)行聚類分析，根據(jù)歐氏距離D2＝16.08 將不同產(chǎn)地劃分為3 個(gè)類群，見(jiàn)圖2。類群Ⅰ共5 個(gè)產(chǎn)地，均為浙產(chǎn)白術(shù)，分別為浙江磐安、浙江新昌、浙江於潛、浙江東陽(yáng)、浙江慶元，該類群塊莖較瘦長(zhǎng)，中等大小，倍半萜含有量較高；類群Ⅱ、Ⅲ各有1 個(gè)產(chǎn)地，為非浙產(chǎn)白術(shù)，分別為河南溫縣與安徽亳州，前者產(chǎn)塊莖較小，后者產(chǎn)塊莖較大而寬胖，兩者倍半萜含有量均較低。

3 討論與結(jié)論

圖2 7 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of seven batches of samples

本實(shí)驗(yàn)顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的最大檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ與蒼術(shù)酮的最大檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，所以確定檢測(cè)波長(zhǎng)為220、276 nm；考察了流動(dòng)相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸）、提取方法（超聲、索式提取、加熱回流）、提取時(shí)間（20、30、40 min）對(duì)白術(shù)倍半萜成分含有量的影響，發(fā)現(xiàn)4 種成分在甲醇中超聲處理（2 509 W，33 kHz）30 min 即可提取完全，以乙腈-水為流動(dòng)相洗脫效果較好，各峰之間的分離度＞1.5，理論塔板數(shù)＞3 000，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮保留時(shí)間分別為24.238、17.644、25.014、41.202 min，定量限分別為1.84、2.32、0.037、10.96 μg／mL，檢測(cè)限分別為0.76、1.07、0.021、10.96 μg／mL。

藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育情況及環(huán)境條件對(duì)次生代謝產(chǎn)物積累都具有重要的影響，包括生長(zhǎng)性狀、經(jīng)緯度、海拔、降雨量等［21］。本實(shí)驗(yàn)顯示，7 個(gè)產(chǎn)地白術(shù)塊莖中4 種倍半萜含有量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），其中浙江產(chǎn)高于安徽、河南產(chǎn)；海拔、年平均溫度與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)酮含有量呈正相關(guān)，而且相關(guān)性系數(shù)較大。課題組發(fā)現(xiàn)，浙江於潛的海拔為377 m，遠(yuǎn)低于浙江磐安的661 m，但前者產(chǎn)樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ蒼術(shù)酮的含有量卻高于后者產(chǎn)，可能是由于前者海拔過(guò)高，導(dǎo)致年平均溫度低于后者，影響了倍半萜在白術(shù)塊莖中的積累，也表明於潛特定的生境因子可能是當(dāng)?shù)仄贩N品質(zhì)較好的原因之一。高經(jīng)度、低緯度、高海拔的環(huán)境有利于白術(shù)倍半萜類成分積累，故可優(yōu)先在擁有上述地域條件的浙江種質(zhì)中選擇。對(duì)于安徽、河南產(chǎn)地白術(shù)，本實(shí)驗(yàn)分別只收集到了1 個(gè)樣本，代表性較弱，下一步將繼續(xù)進(jìn)行安徽、河南、湖南等非浙江產(chǎn)地的資源收集與含有量測(cè)定。