基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討射干-麻黃治療哮喘的機(jī)制

黃秀芳，劉城鑫，黃慧婷，徐衛(wèi)方，劉 瓊，劉小虹?

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518000）

哮喘是世界上最常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病，隨著吸煙和過(guò)敏率的增加，以及空氣污染和人口老齡化，其發(fā)病率逐年上升，在1%～21% 之間［1］，除了常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)（如喘息、呼吸短促、胸悶和咳嗽等）外，還可引起呼吸衰竭、心血管疾病、腎臟疾病、猝死等并發(fā)癥，不僅危害人類健康，還增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜［2］，現(xiàn)公認(rèn)的包括慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、可逆性氣道限制、氣道免疫炎癥和神經(jīng)調(diào)節(jié)導(dǎo)致的氣道重塑［3］。臨床常用藥物有支氣管擴(kuò)張劑和吸入性皮質(zhì)類固醇，然而其副作用和患者耐受性使長(zhǎng)期治療受到限制［4］，因此，開(kāi)發(fā)天然的中草藥可為相關(guān)研究提供新的思考方向。

射干-麻黃來(lái)自《金匱要略》 中的射干麻黃湯，射干味苦，性寒，具有止咳化痰的功效；麻黃性溫，味辛、微苦，有宣肺平喘的功效，兩者配伍，共同發(fā)揮宣肺平喘、止咳化痰作用。現(xiàn)代藥理研究表明，射干具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、雌性激素樣等作用［5］，而麻黃則具有松弛支氣管平滑肌、免疫抑制、抗氧化、鎮(zhèn)咳平喘等作用，配伍后治療哮喘的前景廣闊［6］。劉小虹教授從事肺系疾病治療30 余年，對(duì)哮喘有獨(dú)特的醫(yī)治心得，本研究收集她于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院嶺南名醫(yī)診區(qū)坐診時(shí)的哮喘病歷資料，以古今醫(yī)案云平臺(tái)（V1.5.7）分析使用頻次最高的藥對(duì)，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 資料與方法

1.1 處方來(lái)源 收集2017 年12 月至2019 年1 月劉小虹教授于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院嶺南名醫(yī)診區(qū)坐診時(shí)的病歷資料，均涉及支氣管哮喘。

1.2 處方納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)①診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘醫(yī)學(xué)組制定的《支氣管哮喘防治指南（2016 版）》，并排除其他疾病所引起的喘息、氣急、胸悶及咳嗽；②病歷記載詳細(xì)、完整、準(zhǔn)確，包括患者年齡、診次、病史、癥狀、診斷、方藥等；③有不少于1 次的復(fù)診記錄，并且治療后患者主觀癥狀或客觀指標(biāo)改善。排除標(biāo)準(zhǔn)①不符合支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，或確診引起肺功能改變的其他疾病，如慢阻肺、肺結(jié)核、急性呼吸窘迫綜合征、肺炎等，以及近期有手術(shù)、外傷等影響呼吸功能的；②病案中關(guān)鍵信息（如主訴、現(xiàn)病史、刻下癥、證候診斷、方藥等）記錄不完整；③2 次就診記錄之間，在其他醫(yī)院門診已開(kāi)具處方治療；④合并其他心、腦、腎等危重疾病。

1.3 數(shù)據(jù)規(guī)范化與錄入 60 首門診處方參照《中藥學(xué)》［7］規(guī)范統(tǒng)一藥物名稱，如蛤殼＝海蛤殼、甘草片＝甘草、姜厚樸＝厚樸、甘草泡地龍＝地龍、冬瓜子＝冬瓜仁等。由2 位研究者分別將門診病歷錄入Microsoft Excel 中，經(jīng)第3 位研究者進(jìn)行審核，并按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范化處理，最后統(tǒng)一導(dǎo)入古今醫(yī)案云平臺(tái)中，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析挖掘。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 導(dǎo)入古今醫(yī)案云平臺(tái)后，執(zhí)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化選項(xiàng)，并將結(jié)果批量加入分析池，執(zhí)行藥頻統(tǒng)計(jì)、用藥規(guī)律分析等功能。

1.5 射干-麻黃活性組分與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的篩選 射干-麻黃的活性化合物來(lái)源于TCMSP（http：／／ibts.hkbu.edu.hk／LSP／tcmsp.php），含有大量中草藥的化學(xué)成分和藥物的動(dòng)力學(xué)特性信息。其中，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）代表藥物散布于體循環(huán)的效率，類藥性（drug-likeness，DL）則代表優(yōu)化的藥代動(dòng)力學(xué)和藥物性質(zhì)。本研究選擇OB≥30%、DL≥0.18，并結(jié)合已報(bào)道的麻黃與射干中含有量較高的活性成分，得出射干-麻黃藥對(duì)有效化合物［5，8］，并借助TCMSP 篩選出相關(guān)靶點(diǎn)，輸入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“human”，獲得蛋白靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)的基因信息，將化合物-靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件進(jìn)行可視化。

1.6 與哮喘有關(guān)的靶點(diǎn)篩選 哮喘有關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)來(lái)自2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)：（1）Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.drugbank.ca／），可獲取與哮喘相關(guān)的靶點(diǎn)［9］；（2）TTD（http：／／systemsdock.unit.osit.jp／iddp／home／index），包含有關(guān)治療性蛋白質(zhì)的基因靶點(diǎn)、相關(guān)疾病、途徑和相應(yīng)藥物。從中獲得與哮喘相關(guān)的靶點(diǎn)，輸入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“human”，獲得蛋白靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)的基因信息，將哮喘-靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行可視化［9］。

1.7 核心靶點(diǎn)的篩選與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建 將射干-麻黃藥對(duì)的靶點(diǎn)和與哮喘有關(guān)的靶點(diǎn)上傳至在線Draw Venn Diagram（bioinformatics.psb.ugent.be／Webtools／Venn／），

得到兩者的交集核心靶點(diǎn)，輸入String 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／string-db.org／），得到互作關(guān)系，以Combined score＞0.4 為篩查標(biāo)準(zhǔn)［10］。

1.8 核心靶點(diǎn)的GO 分析 Metascape 可幫助生物醫(yī)學(xué)研究界分析基因／蛋白質(zhì)列表，作出更好的數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)決策。將核心靶點(diǎn)輸入Metascape 進(jìn)行GO分析，即可獲得核心靶點(diǎn)的GO 信息，參數(shù)設(shè)置為H species（1）［11］。

1.9 核心靶點(diǎn)的KEGG 通過(guò)David 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／david.ncifcrf.gov／home.jsp）對(duì)核心靶點(diǎn) 行 KEGG 通路分析，參數(shù)設(shè)置為“ homo sapiens”，限定只展示P＜0.05 的KEGG 結(jié)果［12］。

2 結(jié)果

2.1 治療哮喘藥物頻次統(tǒng)計(jì) 共錄入60 首門診處方，核心藥物是射干、麻黃、紫蘇葉、浙貝母、杏仁、甘草、防風(fēng)、款冬花、法半夏、紫蘇子、紫菀等，其中射干、麻黃出現(xiàn)頻次最高，均為60 次，說(shuō)明兩者在治療哮喘中具有重要意義。見(jiàn)圖1。

圖1 治療哮喘核心藥物頻次Fig.1 Frequency of core drugs for asthmatic treatment

2.2 核心藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則 采用Apriori 算法，支持度越高時(shí)，越能體現(xiàn)其核心規(guī)律。置信度表示當(dāng)“-＞”左邊的藥物出現(xiàn)時(shí)，“-＞”右邊藥物出現(xiàn)的概率，其中射干、麻黃支持度、置信度均為1，表示處方中出現(xiàn)其中一者時(shí)，另一者出現(xiàn)的可能性是100%。其他藥物見(jiàn)表1。

2.3 治療哮喘藥物頻次統(tǒng)計(jì) 通過(guò)TCMSP 篩選得出射干-麻黃有效化合物共有42 個(gè)，18 個(gè)來(lái)自射干，24 個(gè)來(lái)自麻黃，將其合并后刪除重復(fù)項(xiàng)，剩余40 個(gè)，見(jiàn)表2。

2.4 射干-麻黃-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 射干-麻黃靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共包括762 個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括40 個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、722 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，并含有1 524 條互相作用的邊，表示所含化合物與相互作用之間的關(guān)系；節(jié)點(diǎn)的度值表示邊或目標(biāo)的數(shù)量，度值越高的化合物或靶點(diǎn)，在網(wǎng)絡(luò)中可能是越關(guān)鍵的樞紐。射干-麻黃存在1 個(gè)化合物與多個(gè)靶點(diǎn)的互相作用，也存在不同化合物作用于同1 個(gè)靶點(diǎn)，本研究確定了9 個(gè)節(jié)點(diǎn)度值≥22 度的化合物、6 個(gè)節(jié)點(diǎn)度值≥10 度的靶點(diǎn)。具體而言，槲皮素、木犀草素、豆甾醇、山柰酚、環(huán)鳶尾醛型三萜、柚皮素、β-谷甾醇、麻黃堿分別作用于146、112、62、58、36、36、36、24個(gè)靶點(diǎn)，可能是射干-麻黃重要的生物活性成分；PTGS2、PTGS1、HSP90AB1、NCOA2、AR、PIK3CG 分別與30、26、24、19、12、11 個(gè)化合物間有聯(lián)系，可能是其發(fā)揮藥性的重要基礎(chǔ)。見(jiàn)圖2。

表1 治療哮喘核心藥物間置信度Tab.1 Contradictions between core drugs for asthmatic treatment

表2 射干-麻黃中40 個(gè)有效化合物Tab.2 Forty effective compounds in Belamcandae Rhizoma-Ephedrae Herba

圖2 射干-麻黃-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram for Belamcandae Rhizoma-Ephedrae Herba

2.5 哮喘-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)Drugbank、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)得出與哮喘相關(guān)的88 個(gè)作用靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件進(jìn)行可視化，與哮喘相關(guān)的包括NPSR1、CYSLTR1、MYLK、ADORA2A、ADORA2B、ADRA2C、ALOX5、SERPINC1、NPR1、ADRB2、BDKRB2 等。見(jiàn)圖3。

圖3 哮喘-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Target network diagram for asthma-targets

2.6 射干-麻黃與哮喘的核心靶點(diǎn)的構(gòu)建 通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)得出射干-麻黃有效化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，刪除重復(fù)的后共有256 個(gè)，通過(guò)Drugbank、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得與哮喘相關(guān)的基因88 個(gè)，在線軟件進(jìn)行交集分析后發(fā)現(xiàn)15 個(gè)，包括PTGER3、CHRM4、ADRA2C、SERPINE1、NOS2、ALOX5、PTGS2、ERBB2、IL-4、PDE3A、ADRB2、CCL2、CHRM2、CHRNA7、OPRM1，見(jiàn)圖4。將射干-麻黃與哮喘核心靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.0 進(jìn)行分析，其中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)蛋白，邊則代表靶點(diǎn)蛋白與靶點(diǎn)蛋白相互作用的關(guān)系，PPI 提示該網(wǎng)絡(luò)含有15 個(gè)節(jié)點(diǎn)、33 條邊，節(jié)點(diǎn)度的平均值為4.4，見(jiàn)圖5。

圖4 射干-麻黃-靶點(diǎn)與哮喘-靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.4 Venn diagram for Belamcandae Rhizoma-Ephedrae Herba-target and asthma-target

圖5 射干-麻黃與哮喘核心靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 PPI network diagram for core targets for Belamcandae Rhizoma-Ephedrae Herba and asthma

2.7 射干-麻黃與哮喘核心靶點(diǎn)的GO 分析 圖6提示，射干-麻黃與哮喘核心靶點(diǎn)主要涉及的生物學(xué)功能包括白細(xì)胞介素-4 和白細(xì)胞介素-13 信號(hào)傳導(dǎo)、G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路，以及環(huán)核苷酸第二信使偶聯(lián)、鈣信號(hào)通路、平滑肌收縮、信號(hào)受體活性的調(diào)節(jié)、cAMP 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、發(fā)熱、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程、蛋白激酶活性的正調(diào)節(jié)、血管生成、癌癥的途徑等。

圖6 射干-麻黃與哮喘核心靶點(diǎn)的GO 分析Fig.6 GO analysis of core targets for Belamcandae Rhizoma-Ephedrae Herba and asthma

2.8 射干-麻黃與哮喘核心靶點(diǎn)的KEGG 分析 表3 提示，射干-麻黃藥對(duì)與哮喘核心靶點(diǎn)主要涉及的通路包括鈣信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解、cAMP 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、膽堿能突觸、癌癥的途徑、cGMP-PKG 信號(hào)通路。

3 討論

哮喘是一種常見(jiàn)的復(fù)雜呼吸系統(tǒng)疾病，中藥不僅控制其癥狀，還可提高患者日常生活質(zhì)量，減少急性發(fā)作的次數(shù)［9］。射干-麻黃來(lái)源于《金匱要略》，其中射干具有抗炎、鎮(zhèn)痛、祛痰、平喘、抑菌、抗病毒、抗腫瘤的作用，以及雌性激素樣與增強(qiáng)體液免疫活性，臨床主要用于治療支氣管哮喘，支氣管炎，慢性阻塞性肺疾病等肺系疾?。?3-14］；麻黃主要具有解熱發(fā)汗、鎮(zhèn)咳平喘、利尿、免疫抗炎、抗菌、抗病原微生物、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用，臨床主要用于治療感冒、支氣管哮喘、腎炎等［5，15］。本研究通過(guò)收集劉小虹教授治療哮喘的驗(yàn)案，并使用古今醫(yī)案云平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，進(jìn)一步證明了射干-麻黃是治療哮喘的常用藥對(duì)。

射干-麻黃藥對(duì)具有40 個(gè)有效化合物，作用于722 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，其中作用最強(qiáng)的前8 個(gè)包括槲皮素、木犀草素、豆甾醇、柚皮素、β-谷甾醇、麻黃堿等。槲皮素可明顯減輕大鼠哮喘癥狀和IL-5、IL-6 水平，并能降低血中嗜酸粒細(xì)胞及IgE 水平，升高IFN-γ 水平，還可下調(diào)哮喘模型鼠氣道上皮TLR4／NF-κB 表達(dá)，減輕氣道炎癥［16-18］；木犀草素可能通過(guò)調(diào)控PPARγ 表達(dá)和p38MAPK 信號(hào)通路而抑制哮喘大鼠氣道炎癥，從而起到抑制平滑肌重塑的作用，還可降低哮喘模型大鼠血清中IL-4 水平，升高IFN-γ 水平［19-20］；豆甾醇可減少哮喘模型豚鼠細(xì)支氣管周圍、血管周圍和肺泡炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，并可逆轉(zhuǎn)膠原沉積［21］；柚皮素可緩解哮喘模型小鼠氣道的慢性炎癥，還可降低支氣管肺泡灌洗液中Th2 水平和血清中IgE 水平，同時(shí)延緩氣道重塑的進(jìn)展［22］；β-谷甾醇抑制哮喘模型豚鼠TNFα、IL-4、IL-5 水平，可預(yù)防肺組織組織病理學(xué)中的氣道炎癥，抑制Th2 細(xì)胞因子的釋放／合成［23］；麻黃堿具有松弛支氣管平滑肌、抗氧化、抗病毒、抗癌、鎮(zhèn)咳平喘的作用，還可降低iNOS 水平，減輕 哮喘模型小鼠的癥狀［6，24］；化合物-靶點(diǎn)中PTGS2、PTGS1 即是COX2、COX1，山柰酚可通過(guò)抑制COX2 介導(dǎo)的致敏肥大細(xì)胞中前列腺素D2 產(chǎn)生來(lái)抑制哮喘小鼠的氣道壁增厚［25］。氟替卡松、布地奈德和曲安西龍均可顯著降低COX2 與COX1表達(dá)，從而起到治療哮喘的作用［26］。HSP90AB1參與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)和特定靶蛋白，涉及細(xì)胞周期控制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)與ATP 酶活性相關(guān)的功能循環(huán)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系［27］。AR 缺陷的肺泡巨噬細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞募集趨化因子和IL-5 減少，揭示它促進(jìn)M2 巨噬細(xì)胞極化的新穎作用［28］。NCOA2 與PIK3CG 均與脂質(zhì)代謝相關(guān)，其中NCOA2 還與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)［29-31］。射干與麻黃均具有抗腫瘤的作用，GO、KEGG 分析都提示兩者具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和能量代謝的功能，這可能是它們發(fā)揮抗腫瘤、調(diào)節(jié)脂質(zhì)、熱量代謝的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。射干-麻黃治療哮喘是多途徑的協(xié)同增效作用，如調(diào)節(jié)炎性因子NOS2、PTGS2、IL-4；PTGER3 是前列腺素E2 鑒定的4 種受體之一，其基因多態(tài)性在阿司匹林哮喘的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［32］。SERPINE1 是一種糖蛋白，可促進(jìn)氣道纖維化，可能在慢性哮喘氣道炎癥的背景下導(dǎo)致氣道阻塞［33］。研究表明，ALOX5 與基因多態(tài)性之間存在遺傳關(guān)聯(lián)，可以作為阿司匹林哮喘治療反應(yīng)的診斷標(biāo)志物或預(yù)測(cè)因子［34］。上皮生長(zhǎng)因子（EGF）家族成員在上皮細(xì)胞分化，增殖和修復(fù)中起重要作用，據(jù)報(bào)道哮喘患者中ERBB2 表達(dá)較低，限制了上皮修復(fù)過(guò)程，故恢復(fù)其穩(wěn)態(tài)功能應(yīng)被視為新的哮喘治療靶點(diǎn)［35］。異丁司特在日本被廣泛用于治療哮喘，其作用方式是通過(guò)抑制環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（PDEs），但其優(yōu)先抑制PDE3A，可能成為治療哮喘的新途徑［36］。ADRB2 基因中的Glu27 變體與哮喘急性發(fā)作的頻率增加相關(guān)，CHRM2 多態(tài)性與哮喘的遺傳病因?qū)W有關(guān)，CCL2 哮喘介導(dǎo)趨化性，在哮喘模型鼠中的水平明顯增高［37-39］，這說(shuō)明所得核心靶點(diǎn)大部分與哮喘發(fā)生有關(guān)，可能是射干-麻黃發(fā)揮治療哮喘的潛在靶點(diǎn)。

表3 射干-麻黃與哮喘核心靶點(diǎn)的KEGG 分析Tab.3 KEGG analysis of core targets for Belamcandae Rhizoma-Ephedrae Herba and asthma

從GO、KEGG 富集分析可知，核心靶點(diǎn)主要富集于白細(xì)胞介素-4 和白細(xì)胞介素-13 信號(hào)傳導(dǎo)、鈣信號(hào)通路、平滑肌收縮、cAMP 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、蛋白激酶活性的正調(diào)節(jié)、癌癥的途徑、HIF-1 信號(hào)通路、膽堿能突觸、cGMPPKG 信號(hào)通路等，其中與哮喘最相關(guān)的包括鈣信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-4 和白細(xì)胞介素-13 信號(hào)信號(hào)傳導(dǎo)、膽堿能突觸、cGMP-PKG；調(diào)節(jié)熱量或脂質(zhì)代謝有可能是射干-麻黃潛在的藥理作用，對(duì)心血管系統(tǒng)有一定的干預(yù)作用，而涉及的癌癥途徑更是證明了兩者具有抗腫瘤活性，與先前研究一致，也印證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的準(zhǔn)確性。