黃芪多糖體外對非接觸共培養(yǎng)HUVECs 細(xì)胞誘導(dǎo)SGC7901 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

唐有為，李燁婷

（重慶市腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400030）

2018 年世界范圍內(nèi)，胃癌患者的新增病例數(shù)是100 萬，由胃癌造成的死亡超過78 萬，發(fā)病率在所有癌癥中排名第五，死亡率排名第三，男性發(fā)病率是女性的2 倍，中國胃癌發(fā)病人數(shù)占全球40%［1］。目前，國內(nèi)由于早期篩查的缺乏，胃癌發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已經(jīng)到了中晚期［2-3］，而對于中晚期胃癌患者，轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因之一［4］，因此，抑制或延緩胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移對延長和改善胃癌患者的生存期及生存質(zhì)量具有重要的意義。胃癌轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）具有密切關(guān)系，后者可使上皮性腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)表型，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［5-6］。

在腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞之間相互協(xié)同，共同促進(jìn)腫瘤發(fā)展［7］，非腫瘤細(xì)胞包括炎癥細(xì)胞［8］、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。在多個(gè)腫瘤中均發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用可通過誘導(dǎo)EMT 的發(fā)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［9-11］。研究表明，黃芪多糖（APS）可通過抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和周期阻滯，抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［12］，但對血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響尚未見報(bào)道。本研究將通過非接觸共培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞與胃癌細(xì)胞系SGC7901，探索黃芪多糖對正常人血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞系SGC7901 細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs 購自美國ATCC 公司。

1.2 試劑與藥物 黃芪多糖（批號(hào)HQ090312，純度98%）購自陜西森弗生物技術(shù)有限公司。DMEM 高糖培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司；FBS 購自北京四季青生物科技有限公司；胰蛋白酶、RIPA裂解液、超敏型ECL 檢測試劑、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、SDSPAGE 電泳液、蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)膜液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MMP-2、MMP-9、LOX、Snail1 均為兔單克隆抗體，購自英國Abcam 公司；DyLight488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自美國GeneTex公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購買自美國CST公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒購買自寶日生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SGC7901 細(xì)胞和HUVECs 細(xì)胞均加入含有10% FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至80%～90%的融合度時(shí)傳代。

2.2 MTT 檢測 待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并配制成細(xì)胞濃度1.5×105／mL 的單細(xì)胞懸液，以每孔100 μL 種植于96 孔板中，貼壁后加入黃芪多糖（2.5、5、10、20、40 mg／mL），并在對照組中加入相同體積的水，處理24、48、72 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL）培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀在490 nm處檢測每個(gè)孔的光密度（OD），計(jì)算抑制率。

2.3 共培養(yǎng)系統(tǒng)建立 將對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞以1×106／mL 濃度接種于6 孔板中，每孔2.5 mL；在Transwell 共培養(yǎng)系統(tǒng)中，在上室中加入細(xì)胞濃度1×105／mL 的HUVECs 細(xì)胞1.5 mL，以含有10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基作為單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后，收集下室SGC7901 細(xì)胞。SGC7901 組單獨(dú)培養(yǎng)SGC7901 細(xì)胞，HUVECs／ SGC7901 組按照上述共培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)HUVECs／ SGC7901 細(xì)胞，黃芪多糖組在共培養(yǎng)HUVECs／ SGC7901 細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞中加入黃芪多糖（10 mg／mL）。每組重復(fù)3 次。

2.4 侵襲、遷移實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期SGC7901 細(xì)胞1.5 mL，以濃度1×105／mL 接種于Matrigel 基質(zhì)膠包埋的Transwell 小室的上室中，SGC7901 組下室中只加入含有10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基，HUVECs／ SGC7901 組在下室中加入細(xì)胞濃度為1×105／mL HUVECs 細(xì)胞2.5 mL，黃芪多糖組在下室中加入細(xì)胞濃度為1×105／mL HUVECs 細(xì)胞2.5 mL和黃芪多糖（10 mg／mL）。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，取出Transwell 小室，-20 ℃無水甲醇固定后PBS洗滌，棉簽輕輕拭去未侵襲過去的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色3 min，PBS 洗滌后，每孔隨機(jī)選取5 個(gè)視野，拍照計(jì)數(shù)。除Tranwell 小室上室中不包埋Matrigel膠外，遷移實(shí)驗(yàn)同侵襲實(shí)驗(yàn)步驟一致。

2.5 qRT-PCR 檢測 經(jīng)48 h 培養(yǎng)后，收集各組SGC7901 細(xì)胞，加入1.5 mL TRIzol，冰上吹打細(xì)胞，室溫靜置5 min，13 000 r／min 離心5 min，吸取上清，加入氯仿，靜置離心，吸取上清加入異丙醇，靜置離心，棄去上清，75%乙醇清洗沉淀，離心棄上清，保留沉淀干燥，用DEPC 水溶解。按照TaKaRa 反應(yīng)試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，30 s，40 個(gè)循環(huán)。目的基因mRNA 相對表達(dá)量＝2-△△Ct，引物序列由TaKaRa 公司設(shè)計(jì)合成，E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）正向5′-CCTACGATTTCCCATCACCA-3′，反向5′-GTCCACGGTCTCCTGTCTGT-3′；波形蛋白（Vimentin）正向5′-GGATTTCTCTGCCTCTTCCA-3′，反向5′-CACCTGTCCGTCTCTGGTTT-3′；β-actin正向5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，反向5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′。

2.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法，細(xì)胞經(jīng)48 h 培養(yǎng)后分組處理。取各組SGC7901 細(xì)胞，胰酶不消化直接在6 孔板中用PBS 洗滌，加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min，PBS 漂洗，加入0.25% Triton 透膜15 min，加入用0.25% Triton 配制的5% BSA 封閉液封閉30 min，吸去封閉液，加入用封閉液配制的一抗，其中MMP-2、MMP-9 以1∶500 稀釋，4 ℃孵育過夜。PBS 洗滌后，加入以1∶2 000稀釋的Dylight488 標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBS 洗滌，熒光顯微鏡拍照，采用Image pro plus 軟件分析光密度值進(jìn)行分析。

2.7 Western blot 實(shí)驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法，細(xì)胞經(jīng)48 h 培養(yǎng)后分組處理。取各組SGC7901 細(xì)胞，PBS 洗滌后加入RIPA 裂解液在冰上裂解細(xì)胞，待細(xì)胞裂解后收集于離心管中，繼續(xù)裂解30 min，13 000 r／min 離心，收集上清，測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，充分變性，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?0%分離膠+5%濃縮膠，按蛋白濃度確定上樣量。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育過夜（其中LOX、Snail1 以及β-actin 均以1∶800 稀釋）、PBS 洗滌后，二抗（1∶2 000）室溫孵育1.5 h，PBS 洗滌，ECL 發(fā)光液顯色，X 光片顯影，拍照，Image pro plus 軟件分析光密度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用多因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪多糖對SGC7901 和HUVECs 細(xì)胞的增殖影響 在同一時(shí)間下黃芪多糖對SGC7901 和HUVECs 細(xì)胞的增殖抑制率均隨其質(zhì)量濃度的增大而升高；在同一質(zhì)量濃度下，黃芪多糖對SGC7901和HUVECs 細(xì)胞的增殖抑制率均隨時(shí)間的增加而上升，具有濃度-時(shí)間依賴性。但SGC7901 和HUVECs 細(xì)胞對黃芪多糖的敏感性不同，黃芪多糖處理SGC7901 細(xì)胞24、48、72 h，IC50分別為19.04、10.07、5.39 mg／mL，而處理HUVECs 細(xì)胞分別為103.32、48.44、28.50 mg／mL。為保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)中黃芪多糖對SGC7901 細(xì)胞具有較好的干預(yù)作用，同時(shí)防止細(xì)胞毒性過大、干預(yù)時(shí)間過長或過短對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，選取48 h 和10 mg／mL 分別作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)時(shí)間和干預(yù)質(zhì)量濃度。見圖1。

圖1 黃芪多糖對SGC7901 細(xì)胞和HUVECs 細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of APS on SGC7901，HUVECs cell proliferation

3.2 黃芪多糖對SGC7901 細(xì)胞侵襲遷移的影響 與SGC7901 組相比，HUVECs／SGC7901 組SGC7901細(xì)胞侵襲遷移能力升高（P＜0.01）；與HUVECs／SGC7901 組相比，黃芪多糖組SGC7901 細(xì)胞侵襲遷移能力下降（P＜0.01）。見圖2。

3.3 黃芪多糖對SGC7901 細(xì)胞E-Cadherin、VimentinmRNA 表達(dá)的影響 與SGC7901 組相比，HUVECs／SGC7901 組SGC7901 細(xì)胞VimentinmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），E-cadherinmRNA 表達(dá)下降（P＜0.05）；與HUVECs／SGC7901 組相比，黃芪多糖組SGC7901 細(xì)胞VimentinmRNA 表達(dá)下降（P＜0.01），E-cadherinmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05）。見圖3。

圖2 黃芪多糖對SGC7901 細(xì)胞侵襲遷移的影響Fig.2 Effects of APS on invasion and migration of SGC7901 cells

圖3 黃芪多糖對SGC7901 細(xì)胞E-Cadherin、Vimentin mRNA 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of APS on E-Cadherin and Vimentin mRNA expression in SGC7901 cells

3.4 黃芪多糖對SGC7901 細(xì)胞MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)的影響 與SGC7901 組相比，HUVECs／SGC7901 組SGC7901 細(xì)胞MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與HUVECs／SGC7901 組相比，黃芪多糖組SGC7901 細(xì)胞MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)下降（P＜0.01）。見圖4。

3.5 黃芪多糖對SGC7901 細(xì)胞LOX、Snail1 蛋白表達(dá)的影響 與SGC7901 組相比，HUVECs／SGC7901 組SGC7901 細(xì)胞LOX、Snail1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與HUVECs／ SGC7901 組相比，黃芪多糖組SGC7901 細(xì)胞LOX、Snail1 蛋白表達(dá)下降（P＜0.01）。見圖5。

4 討論

圖4 黃芪多糖對SGC7901 細(xì)胞MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of APS on MMP2 and MMP9 protein expressions in SGC7901 cells

圖5 黃芪多糖對SGC7901 細(xì)胞LOX、Snail1 蛋白表達(dá)Fig.5 Effects of APS on the protein expressions of LOX and Snail1 in SGC7901 cells

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腫瘤獲得較低分化程度和較高轉(zhuǎn)移的特性中至關(guān)重要，是腫瘤惡化的重要推動(dòng)因素［13］，在網(wǎng)絡(luò)化的細(xì)胞調(diào)控中，EMT受到來自組織、細(xì)胞、分子以及環(huán)境等各個(gè)層面的調(diào)控；在細(xì)胞層面，腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞之間的相互作用在調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT 中扮演重要作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞是襯于血管、淋巴管、心臟等內(nèi)表面的單層扁平上皮細(xì)胞，并形成血管內(nèi)壁，在腫瘤組織中，血管內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞存在著相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT 轉(zhuǎn)化。研究［14］發(fā)現(xiàn)，在頭頸鱗狀癌細(xì)胞中血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的VEGF、IGF 可通過VEGFR-2／HEF1／Akt／Twist1 通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT 轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移；本研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)培養(yǎng)的SGC7901 細(xì)胞相比，與HUVECs 細(xì)胞非接觸共培養(yǎng)的SGC7901 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力顯著升高，提示HUVECs 細(xì)胞對SGC7901 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用。進(jìn)一步對SGC7901 細(xì)胞中EMT 相關(guān)分子的檢測發(fā)現(xiàn)，HUVECs 可促進(jìn)SGC7901 細(xì)胞中MMP2、MMP9、Vimentin、Snail1 表達(dá)增加，抑制 Ecadherin 表達(dá)。在EMT 過程中，上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物E-cadherin、Cytokeratin 等表達(dá)缺失，導(dǎo)致細(xì)胞喪失極性和細(xì)胞間連接；間質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物MMPs、Vimentin、α-SMA 等表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)易發(fā)生變化，同時(shí)對胞外基質(zhì)的降解能力增加，以上因子的綜合變化在腫瘤中導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)錄因子Snail 可調(diào)控EMT。激活的Snail 識(shí)別并結(jié)合到E-cadherin 基因上的Ebox 序列，抑制E-cadherin 的基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的EMT。綜上所述，HUVECs 細(xì)胞可促進(jìn)SGC7901 細(xì)胞的EMT 轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)SGC7901 細(xì)胞轉(zhuǎn)移；給予黃芪多糖干預(yù)后，共培養(yǎng)SGC7901 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，以及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的MMP2、MMP9、Vimentin、Snail1 和表達(dá)下調(diào)的E-cadherin均發(fā)生回調(diào)，提示黃芪多糖可抑制HUVECs 誘導(dǎo)的SGC7901 細(xì)胞的EMT 轉(zhuǎn)化。

目前，對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制可顯著延長患者的總體生存時(shí)間，降低3 年復(fù)發(fā)率［15-16］。EMT 的激活可受多條通路和多個(gè)因子影響，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Notch 信號(hào)通路、STATs 信號(hào)通路［17］、Hedgehog 信號(hào)通路［18-19］均與胃癌的EMT 密切相關(guān)。由于EMT是細(xì)胞逆分化獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，因此其激活與多個(gè)與胚胎發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路的激活尤為密切，包括Wnt 信號(hào)通路［20］、Hedgehog 信號(hào)通路［21］、TGF-β／Smads 信號(hào)通路［22］。Snail 作為轉(zhuǎn)錄因子，可直接通過作用于靶基因調(diào)控EMT 過程中相關(guān)蛋白的表達(dá)，特別是Snail1 和Snail2，可通過進(jìn)入細(xì)胞核識(shí)別靶向序列上的E-Box 序列，其中E-cadherin 基因上存在E-Box 序列，Snail 與E-Box序列的結(jié)合抑制了E-cadherin 的表達(dá)，促進(jìn)Vimentin的表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)了EMT 過程［23］，同時(shí)已證明LOX 可穩(wěn)定Snail1 蛋白［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，與血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)可促進(jìn)SGC7901 細(xì)胞中LOX 和Snail1 蛋白表達(dá)上升，但給予APS 干預(yù)后這種促進(jìn)作用被抑制，同時(shí)共培養(yǎng)SGC7901 細(xì)胞中LOX 和Snail1 蛋白顯著下降，證實(shí)APS 可通過抑制HUVECs 誘導(dǎo)的SGC7901 細(xì)胞LOX 和Snail1蛋白的表達(dá)，阻止SGC7901 細(xì)胞發(fā)生EMT。

綜上所述，HUVECs 細(xì)胞可促進(jìn)胃癌細(xì)胞系SGC7901 細(xì)胞轉(zhuǎn)移，可能是通過HUVECs 誘導(dǎo)SGC7901 細(xì)胞EMT 的激活實(shí)現(xiàn)的，而黃芪多糖可抑制HUVECs 對SGC7901 細(xì)胞的這種誘導(dǎo)作用，但具體是通過哪種信號(hào)通路還需作進(jìn)一步研究。