黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證胃潰瘍大鼠的影響

陳小娟曾梅艷宋厚盼?陳新怡朱曉彤楊 燾蔡 雄

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208）

胃潰瘍（gastric ulcer，GU）是一種臨床常見的多發(fā)性消化系統(tǒng)疾病，主要發(fā)生在胃角、胃竇、賁門、裂孔疝等部位，以餐后上腹部疼痛為主要癥狀，非甾體抗炎藥和酒精是致使其發(fā)生的重要因素。西藥治療GU 有不良反應(yīng)大、治愈率低、復(fù)發(fā)率 高的缺點(diǎn)［1］，仍是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一大難題［2］。2017 年《消化性潰瘍中醫(yī)診療專家共識(shí)意見》 將GU 的中醫(yī)證型分為肝胃不和證、脾胃濕熱證、脾胃虛寒證、肝胃郁熱證、胃絡(luò)瘀阻證和胃陰不足證［3］，臨床研究［4］表明，脾胃虛寒（SSDC）證是該疾病臨床常見證型之一，也是復(fù)發(fā)率最高的。

黃芪建中湯（HQJZD）出自《金匱要略·血痹虛勞病脈證治》，由黃芪、飴糖、桂枝、芍藥、生姜、甘草和大棗組成，飴糖和甘草相配，獨(dú)入脾胃；桂枝配生姜，溫胃散寒；芍藥滋陰柔肝止痛，全方緩急止痛，甘溫建中，使脾胃之寒得除，陽氣內(nèi)升。臨床研究［5］表明，黃芪建中湯治療脾胃虛寒證GU 具有良好的療效，但對(duì)本方相關(guān)作用機(jī)制的報(bào)道較少。本研究通過建立脾胃虛寒型GU 大鼠模型，從大鼠整體狀態(tài)、胃黏膜形態(tài)和細(xì)胞分子層面探究黃芪建中湯治療GU 的作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，雄性，體質(zhì)量150～180 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)室溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度45%～55%，每天保持12 h／12 h 循環(huán)光照／黑暗時(shí)間，自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物 番瀉葉（都振興中藥飲片實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)18022802）。黃芪建中湯由黃芪5 g、桂枝9 g、白芍18 g、甘草6 g、生姜9 g、膠飴30 g、大棗4 枚組成，藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王智講師鑒定為正品。阿司匹林腸溶片（德國拜耳公司，批號(hào)BJ40822）研磨后溶于生理鹽水，制成混懸液，給藥劑量200 mg／kg。無水乙醇（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號(hào)20160227）；埃索美拉唑膠囊（重慶萊美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)G180721）。黃芪建中湯制備方法為藥材按常規(guī)方法煎煮2 次后合并藥液，兌入飴糖，文火加熱融化，恒溫水浴鍋中濃縮至2 g 生藥／mL。番瀉葉水煎劑制備方法為100 g 番瀉葉加入500 mL 蒸餾水煎煮30 min，紗布過濾藥液，煎煮2 次后合并濃縮至1 g 生藥／mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 酚酞（上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)F318BA0010）；氫氧化鈉（上海沃凱生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20180929）；胃蛋白酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20190309）；一氧化氮試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)A012）；TNF-α 試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司，批號(hào)20180824）；IL-4 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)A30480435）；IL-10 試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司，批號(hào)20180824）；兔抗Toll 樣受體2 抗體（TLR-2，批號(hào)AH04173651）、髓樣分化因子88 抗體（MyD88，批號(hào)AG07205376）和山羊抗兔二抗（批號(hào)AG11091289）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)ZLI-9018）；蘇木精（上東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，批號(hào)P4163）；伊紅染液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)150109）；總RNA 提取試劑盒（TRIZOL，批號(hào)EC26KA0636）、M-MuLV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒（批號(hào)EB06KA0085）、2×SG Fast qPCR Master Mix 試劑盒（批號(hào)F415KA1484）購自上海生工生物工程股份有限公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 儀器 T18060501 電子體溫計(jì)（廣東健奧科技有限公司）；MNT-150T 電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺（德國美耐特公司）；5810R 高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；KD-BM Ⅱ電腦生物組織包埋機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；HM 325輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（上海市賽默飛世爾儀器有限公司）；YD-A 生物組織攤片機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；580BR 梯度PCR 儀（美國Bio-Rad公司）；1D97 Lightcycler 480П 熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏公司）；Cytation3 多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；BA410E 三目生物顯微鏡（麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司）。

2 方法

2.1 脾胃虛寒證GU 大鼠模型的構(gòu)建及給藥 采用苦寒瀉下和游泳力竭法建立脾胃虛寒證大鼠模型［6］。60 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)分為正常組、模型組、埃索美拉唑組（4.17 mg／kg）及黃芪建中湯低、高劑量組（9.27、18.54 g／kg），每組12 只。各組大鼠每天12：30 進(jìn)行體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量和肛溫的測量；14：00 正常組大鼠予以1 mL／100 g 蒸餾水灌胃，不做其他任何處理，其余各組大鼠給予1 mL／100 g 番瀉葉水煎劑（1 g 生藥／mL）灌胃。給藥2 h 后，將大鼠放入裝滿常溫自來水的70 cm深的水槽中游泳，至整體沒入水中3 s 時(shí)立即撈起，連續(xù)9 d，建立脾胃虛寒證模型。

無水乙醇可直接破壞胃黏膜屏障，增加細(xì)胞膜通透性，誘發(fā)胃黏膜損傷［7］；阿司匹林能抑制胃黏膜環(huán)氧化酶產(chǎn)生，減少前列腺素合成，從而減弱胃黏膜屏障機(jī)能，使胃酸濃度增加，導(dǎo)致潰瘍形成［8］，本研究以兩者構(gòu)建胃潰瘍模型。第10 天停止造模，在10：00 測定基礎(chǔ)指標(biāo)后，給予單次1 mL／200 g 無水乙醇灌胃，1 h 后再予阿司匹林混懸液（200 mg／kg）連續(xù)灌胃5 d，給藥體積為1 mL／100 g［7-8］，14：00 各給藥組大鼠給予相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥5 d。

2.2 樣本采集 實(shí)驗(yàn)第14 天給藥后，大鼠禁食禁水12 h，第15 天進(jìn)行樣本采集。麻醉大鼠并固定，自胸骨劍突下沿腹中線剪開腹壁，腹主動(dòng)脈采血，于4 ℃、12 000 r／min 離心10 min，分離血清，置于-80 ℃保存。取血完畢后，用手術(shù)縫合線扎緊胃腔幽門，摘取全胃，收集胃內(nèi)容物隨后沿胃小彎剪開胃，數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照，運(yùn)用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量潰瘍大小，對(duì)潰瘍損傷進(jìn)行評(píng)分。剪取一部分胃組織，用4%多聚甲醛固定48 h，進(jìn)行HE 染色和免疫組化檢測；另一部分胃組織放入凍存管，-80 ℃保存，用于后續(xù)其他指標(biāo)檢測。

2.3 一般癥狀和體征 實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察并記錄各組大鼠的整體活動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)光澤、大便形態(tài)、體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量，隔天測量肛溫。

2.4 胃黏膜潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率測定 肉眼觀察胃黏膜是否有水腫、充血、出血和糜爛等損傷，電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量潰瘍和糜爛部位，Guth 法計(jì)算胃黏膜潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率。斑點(diǎn)糜爛，1分，糜爛長度＜1 mm；2 分，糜爛長度1～2 mm；4分，糜爛長度＞4 mm；5 分，寬度＞1 mm 的分值×2［9］。潰瘍抑制率＝ ［（模型組潰瘍指數(shù)-給藥組潰瘍指數(shù)）／模型組潰瘍指數(shù)］× 100%。

2.5 胃黏膜組織病理學(xué)檢測 大鼠胃組織用4%多聚甲醛固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，二甲苯和乙醇脫蠟，蘇木精-伊紅染色，二甲苯透明和中性樹膠封片，切片于顯微鏡200 倍鏡下隨機(jī)選取4 個(gè)視野進(jìn)行拍照，以胃黏膜組織上皮和黏膜層為拍照范圍標(biāo)準(zhǔn)。按照Laine 等［10］報(bào)道的方法，對(duì)圖片進(jìn)行胃黏膜炎性細(xì)胞、出血深度和上皮細(xì)胞丟失評(píng)分。

2.6 胃液總酸度和胃蛋白酶活性檢測 取1 mL 胃液上清液，2% 酚酞作為指示劑，0.01 mmoL／L氫氧化鈉滴定至液體呈微紅色且不變色，檢測胃液總酸度，計(jì)算公式為胃液總酸度＝氫氧化鈉滴定體積×氫氧化鈉濃度［11］。胃液中胃蛋白酶活性則嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.7 大鼠血清中IL-4、IL-10、NO、TNF-α 水平檢測 根據(jù)ELISA 試劑盒操作步驟，對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行檢測。

2.8 大鼠胃組織中TLR-2、MyD88 mRNA 表達(dá)檢測 取胃組織40～50 mg，按照試劑盒說明書步驟，提取總RNA，進(jìn)行純度和濃度檢測后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA；取正常組cDNA 1 μL，用無菌無酶水10倍稀釋成5 個(gè)梯度，用于熒光定量PCR 反應(yīng)，考察線性關(guān)系和引物的擴(kuò)增效率。根據(jù)熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行20 μL 體系配置［2×SG qPCR Master Mix 為10 μL；DNF Buffer 為2 μL；PCR Forward Primer（10 μmol／L）為0.4 μL；PCR Reverse Primer（10 μmol／L）為0.4 μL；cDNA 模板為1 μL；Sterilized ddH2O 為6.2 μL］，按照95 ℃預(yù)變性3 min、95 ℃變性3 s、60 ℃退火、延伸30 s 的反應(yīng)條件擴(kuò)增40 次，繪制擴(kuò)增曲線和溶解曲線。以β-actin 為內(nèi)參基因，2-△△Ct法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.9 大鼠胃組織中TLR-2 和MyD88 蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法。用4%多聚甲醛固定胃黏膜組織48 h 后，依次對(duì)標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、二甲苯和乙醇脫蠟脫水、3%過氧化氫浸泡、蒸餾水和PBS 清洗，隨后通過微波爐加熱PBS 浸泡的切片至沸騰以修復(fù)抗原。5%胎牛血清封閉非特異性抗原，PBS 清洗后分別加入TLR-2 一抗（1∶100）、MyD88 一抗（1∶100），37 ℃孵育1 h，PBS 清洗后滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，于室溫靜置20 min，PBS 清洗后加入山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育30 min，PBS 清洗后采用DBA 顯色，于顯微鏡下觀察，自來水終止反應(yīng)，經(jīng)蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分色、自來水促藍(lán)、二甲苯透明后，采用中性樹膠封片，200 倍鏡下隨機(jī)選取4 個(gè)視野進(jìn)行拍照，以棕黃色區(qū)域作為蛋白表達(dá)區(qū)域，用Image Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行光密度值（IOD）分析。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊采用方差分析；兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠整體狀態(tài) 正常組大鼠毛發(fā)柔順有光澤，反應(yīng)靈敏，動(dòng)作敏捷，嘴唇、舌和趾甲顏色淡紅，大便軟硬適中，整體狀態(tài)良好；模型組大鼠體質(zhì)量增長緩慢，游泳耐力下降，毛發(fā)枯槁無光澤，喜弓背，懶動(dòng)，扎堆明顯，反應(yīng)遲鈍，嘴唇、舌及趾甲呈淡白色，大便稀軟甚至溏泄；經(jīng)藥物治療后，大鼠整體狀態(tài)趨于好轉(zhuǎn)，毛發(fā)有光澤，未見弓背、扎堆等寒象，動(dòng)作靈活，嘴唇、舌和趾甲恢復(fù)淡紅色，大便恢復(fù)正常。

3.2 大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量及肛溫 造模前，各組大鼠的基礎(chǔ)指標(biāo)接近。經(jīng)脾胃虛寒證造模后，與正常組大鼠比較，模型組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量和肛溫均降低（P＜0.05，P＜0.01）；經(jīng)藥物治療后，與模型組比較，黃芪建中湯大鼠體質(zhì)量、飲食量、飲水量、肛溫均增加（P＜0.05，P＜0.01）。見表2～5。

表2 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠體質(zhì)量的影響（±s，n＝12）Tab.2 Effect of HQJZD on body mass of GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝12）

表2 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠體質(zhì)量的影響（±s，n＝12）Tab.2 Effect of HQJZD on body mass of GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝12）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

表3 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠進(jìn)食量的影響（±s，n＝12）Tab.3 Effect of HQJZD on food intake of GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝12）

表3 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠進(jìn)食量的影響（±s，n＝12）Tab.3 Effect of HQJZD on food intake of GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝12）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表4 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠飲水量的影響（±s，n＝12）Tab.4 Effect of HQJZD on water intake of GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝12）

表4 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠飲水量的影響（±s，n＝12）Tab.4 Effect of HQJZD on water intake of GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝12）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

3.3 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃黏膜損傷的影響 正常組大鼠胃黏膜完整、光滑，皺襞清晰，未見水腫、糜爛、出血和潰瘍；模型組大鼠胃黏膜出現(xiàn)損傷，皺襞增厚，可見大量塊狀或線狀的潰瘍和糜爛，并覆有黃色膿液，較正常組潰瘍指數(shù)增加（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪建中湯組大鼠胃黏膜較完整，僅見少量出血點(diǎn)和水腫，潰瘍指數(shù)下降（P＜0.01），低、高劑量組的潰瘍抑制率分別為61.40%和79.04%。見表6、圖1。

表5 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠肛溫的影響（±s，n＝12）Tab.5 Effect of HQJZD on anal temperature of GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝12）

表5 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠肛溫的影響（±s，n＝12）Tab.5 Effect of HQJZD on anal temperature of GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝12）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

表6 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率的影響（±s，n＝6）Tab.6 Effects of HQJZD on gastric mucosal ulcer index and ulcer inhibition rate in GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝6）

表6 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率的影響（±s，n＝6）Tab.6 Effects of HQJZD on gastric mucosal ulcer index and ulcer inhibition rate in GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

圖1 各組大鼠形態(tài)學(xué)圖Fig.1 Morphological images for rats in each group

3.4 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響 正常大鼠腺體結(jié)構(gòu)整齊，各黏膜結(jié)構(gòu)層未見上皮細(xì)胞脫落、炎性細(xì)胞浸潤、出血和水腫等；模型組大鼠胃黏膜層結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，甚至上皮細(xì)胞脫落、出現(xiàn)缺損，黏膜下層有水腫、散在出血，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，肌層可見血管擴(kuò)張、充血明顯，總評(píng)分高于正常組（P＜0.01）。與模型組比較，給藥組胃黏膜損傷總評(píng)分均降低（P＜0.01），埃索美拉唑組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)修復(fù)較完整，有少量的炎性滲出物和炎性細(xì)胞，可見新生血管組織，邊緣再生腺體部分可見囊性擴(kuò)張；黃芪建中湯低劑量組大鼠胃黏膜層雖有一定修復(fù)，但仍可見一定缺損及炎性滲出物；黃芪建中湯高劑量組大鼠胃黏膜層修復(fù)完整，炎性滲出物及炎性細(xì)胞明顯減少，可見囊性擴(kuò)張和新生血管組織。見圖2、表7。

3.5 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃酸和胃蛋白酶的影響 模型組大鼠胃液總酸度和胃蛋白酶活性較正常組升高（P＜0.01）；給藥后，黃芪建中湯低、高劑量組均可降低胃酸總酸度和胃蛋白酶活性（P＜0.01）。見表8。

3.6 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠血清細(xì)胞炎癥因子水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α 水平升高，IL-4、IL-10 和NO 水平降低（P＜0.01）；給藥后，黃芪建中湯低、高劑量組TNF-α 水平下降（P＜0.05，P＜0.01），IL-4、IL-10和NO 水平上升（P＜0.05，P＜0.01）。見表9。

圖2 各組大鼠胃組織病理學(xué)（HE，×200）Fig.2 Gastric histopathologic images for rats in each group（HE，×200）

表7 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響（±s，n＝6）Tab.7 Effect of HQJZD on histopathology of gastric mucosa injury in GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝6）

表7 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響（±s，n＝6）Tab.7 Effect of HQJZD on histopathology of gastric mucosa injury in GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝6）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表8 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃酸總酸度和胃蛋白酶的影響（±s，n＝6）Tab.8 Effects of HQJZD on gastric acidity and pepsin in GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝6）

表8 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃酸總酸度和胃蛋白酶的影響（±s，n＝6）Tab.8 Effects of HQJZD on gastric acidity and pepsin in GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

表9 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠血清中細(xì)胞炎癥因子水平的影響（±s，n＝6）Tab.9 Effects of HQJD on serum cell inflammatory factors in GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝6）

表9 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠血清中細(xì)胞炎癥因子水平的影響（±s，n＝6）Tab.9 Effects of HQJD on serum cell inflammatory factors in GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.7 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃黏膜組織TLR-2、MyD88 mRNA 表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠胃組織中TLR-2、MyD88 mRNA 表達(dá)增加（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪建中湯低、高劑量組TLR-2、MyD88 mRNA 表達(dá)下降（P＜0.01）。見表10。

表10 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃組織中TLR-2、MyD88 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝6）Tab.10 Effects of HQJZD on TLR-2 and MyD88 mRNA expressions in gastric tissues of GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝6）

表10 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃組織中TLR-2、MyD88 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝6）Tab.10 Effects of HQJZD on TLR-2 and MyD88 mRNA expressions in gastric tissues of GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.8 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃組織中TLR-2 和MyD88 蛋白表達(dá)的影響 TLR-2 和MyD88蛋白表達(dá)差異主要呈現(xiàn)在胃黏膜的上皮層，其余部位未見明顯差異。與正常組比較，模型組大鼠胃組織TLR-2 和MyD88 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪建中湯低、高劑量組TLR-2 和MyD88 蛋白表達(dá)均下調(diào)（P＜0.01）。見表11、圖3～4。

表11 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃組織中TLR-2和MyD88 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）Tab.11 Effects of HQJZD on TLR-2 and MyD88 protein expressions in gastric tissue of GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝6）

表11 黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒證GU 大鼠胃組織中TLR-2和MyD88 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）Tab.11 Effects of HQJZD on TLR-2 and MyD88 protein expressions in gastric tissue of GU rats of SSDC Pattern（±s，n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

4 討論

圖3 各組大鼠胃黏膜組織TLR-2 蛋白表達(dá)（免疫組化，×200）Fig.3 TLR-2 protein expressions in gastric mucosa of rats in each group（immunohistochemistry，×200）

圖4 各組大鼠胃黏膜組織MyD88 蛋白表達(dá)（免疫組化，×200）Fig.4 MyD88 protein expressions in gastric mucosa of rats in each group（immunohistochemistry，×200）

胃潰瘍（GU）歸屬于中醫(yī)“胃脘痛”“心痛”“嘈雜”等范疇，主要病機(jī)為虛實(shí)夾雜，脾胃虛寒證是其臨床常見的證型之一，2017 年《消化性潰瘍中醫(yī)診療共識(shí)意見》 將黃芪建中湯列為治療脾胃虛寒型消化性潰瘍的基礎(chǔ)方［3］，它在臨床治療GU 時(shí)被證實(shí)具有確切的療效。本研究根據(jù)“苦寒之藥損其脾胃”和“勞倦傷脾”的理論建立了脾胃虛寒證候動(dòng)物模型，并聯(lián)合使用無水乙醇和阿司匹林進(jìn)行潰瘍誘導(dǎo)［12-14］，可為黃芪建中湯治療GU作用機(jī)制的研究提供載體。

給予黃芪建中湯治療后，大鼠整體狀態(tài)逐漸恢復(fù)，給藥組各項(xiàng)基礎(chǔ)指標(biāo)與模型組比較有顯著性差異，說明該方可有效改善大鼠的脾胃虛寒癥狀。與模型組比較，黃芪建中湯可顯著降低胃酸總酸度和胃蛋白酶活性，改善胃內(nèi)環(huán)境，大鼠胃黏膜的出血、糜爛和水腫范圍明顯縮小，胃黏膜潰瘍指數(shù)顯著降低。HE 染色結(jié)果表明，黃芪建中湯可有效修復(fù)胃黏膜損傷，抑制炎性細(xì)胞的分泌和減少上皮細(xì)胞的丟失，促使胃黏膜恢復(fù)正常狀態(tài)。

NO 通過提高胃血流量促進(jìn)潰瘍的愈合，維持黏膜完整性［15］，Liu 等［16］認(rèn)為，NO 的增加可改善局部血管微循環(huán)，加速血管結(jié)構(gòu)的修復(fù)；另有研究［17］表明，NO 有可能通過抑制胃酸分泌，增加胃黏膜血流量，從而對(duì)胃黏膜起到保護(hù)和修復(fù)作用；本研究結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)黃芪建中湯治療后，血清中的NO 水平顯著上升。TNF-α 通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤胃黏膜引發(fā)炎癥反應(yīng)，可抑制黏膜潰瘍邊緣的微循環(huán)、細(xì)胞增殖和血管再生，減緩潰瘍的愈合［18］，它和IL-1 等炎性因子可激活I(lǐng)-κBa／NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)局部的炎癥反應(yīng)；NF-κB 可誘導(dǎo)TNF-α 的產(chǎn)生，從而進(jìn)入炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)［19］；致病因素通過MAP 激酶和NF-κB 的磷酸化，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α 等促炎因子，直接作用于胃黏膜，導(dǎo)致組織損傷［20-21］，本研究中模型組大鼠血清TNF-α 水平顯著增加，經(jīng)黃芪建中湯治療后顯著下降。有研究［22］表明，IL-4 和IL-10 是抑制胃黏膜炎癥的主要抗炎因子，IL-4 可抑制單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，IL-10 可降低B 細(xì)胞活性，抑制免疫反應(yīng)，從而減少TNF-α、IL-1 等促炎因子的分泌，減緩氧自由基、脂質(zhì)過氧化［23］，表9 顯示，給予黃芪建中湯后大鼠血清中兩者水平顯著上升，提示該方可能通過抑制促炎因子的釋放、減緩氧自由基的過氧化殺傷，從而恢復(fù)細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖，加速潰瘍的修復(fù)。

Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）是一類跨膜蛋白識(shí)別受體，能夠識(shí)別不同的病原相關(guān)分子模式，通過MyD88 或MyD88 非依賴途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答［24］，其中TLR-2 與胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在胃黏膜炎癥和潰瘍中表達(dá)顯著增高［25］。研究表明，大多數(shù)受調(diào)控的基因依賴TLR 信號(hào)傳導(dǎo)，TLR-2 通過MyD88 依賴途徑激活NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子的活化，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞等分泌炎性細(xì)胞（如TNF-α、IL-6、IL-12 等）抑制IL-4、IL-10 的分泌。表10～11 顯示，大鼠潰瘍黏膜組織TLR-2、MyD88 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，給予黃芪建中湯治療后均降低。

綜上所述，黃芪建中湯治療胃潰瘍的作用機(jī)制可能與調(diào)控TLR-2／MyD88 信號(hào)通路、抑制促炎因子生成、加速抗炎因子分泌、增加胃黏膜血流量、促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖有關(guān)。課題組下一步將從潰瘍愈合率、患者依從性、復(fù)發(fā)率、毒副作用等方面出發(fā)，系統(tǒng)考察黃芪建中湯單用或聯(lián)合西藥治療胃潰瘍相比單純采用西藥的優(yōu)勢。