HPLC 法同時(shí)測(cè)定小兒香橘丸中4 種成分

楊 璐王麗瓊稅丕先?

（1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.樂(lè)山市食品藥品監(jiān)督稽查支隊(duì)，四川 樂(lè)山 614000；3.樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂(lè)山 614000）

小兒香橘丸是由木香、陳皮、蒼術(shù)（米泔炒）、炒白術(shù)、茯苓、甘草、白扁豆（去皮）、山藥（去皮）、蓮子、薏苡仁（麩炒）、炒山楂、炒麥芽、六神曲（麩炒）、姜厚樸、枳實(shí)（麩炒）、醋香附、砂仁、法半夏、澤瀉19 味藥材組成的大蜜丸，功效健脾和胃、消食止瀉，臨床用于治療小兒厭食癥［1］。方中陳皮、枳實(shí)（麩炒）以橙皮苷為指標(biāo)成分，具有溫胃散寒、理氣健脾的作用［2］；姜厚樸主要成分為木脂素（和厚樸酚、厚樸酚）［3］，具有抗腹瀉作用，可促進(jìn)胃排空和腸推進(jìn)，常作為該藥材指標(biāo)化合物［4-6］；醋香附指標(biāo)成分α-香附酮是其調(diào)經(jīng)解痛的主要有效物質(zhì)［7］，用于衡量相關(guān)制劑質(zhì)量?jī)?yōu)劣［8-9］。

中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提倡多指標(biāo)成分含有量測(cè)定［10-11］，同時(shí)其成分復(fù)雜，性質(zhì)差異大，紫外吸收各異，故采用多波長(zhǎng)可實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)［12-14］。小兒香橘丸現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的含有量測(cè)定部分只涉及橙皮苷［15］，不夠完善，故本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定其中橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮的含有量，以期為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考；在色譜峰定性上，對(duì)保留時(shí)間差異不大、光譜相似的組分峰采用選定波長(zhǎng)處吸收度比值進(jìn)行區(qū)分，取得了滿意結(jié)果，可為復(fù)雜組分的色譜峰定性提供一定思路。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、OpenLAB CDS 工作站（美國(guó)Agilent 公司）；XSE205DU 電子天平（十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；CQ-100B 超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）；ULUP-II-10T 優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）。

橙皮苷（批號(hào)110721-201818，純度96.2%）、和厚樸酚（批號(hào)110730-201614，純度99.3%）、厚樸酚（批號(hào)110729-201513，純度98.8%）、α-香附酮（批號(hào)110748-201513，純度99.7%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。小兒香橘丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，每丸3 g，批號(hào)15015420、16015811、16015845）。白扁豆、六神曲（麩炒）經(jīng)樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心朱敏鳳主管中藥師鑒定為正品，其余13 味對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純（北京百靈威科技有限公司）；甲醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司）、磷酸［重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司］為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品貯備液 精密稱取橙皮苷對(duì)照品66.48 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻；精密稱取和厚樸酚對(duì)照品13.16 mg、厚樸酚對(duì)照品29.08 mg，置于同一50 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻；精密稱取α-香附酮對(duì)照品10.05 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下橙皮苷對(duì)照品貯備液5 mL、和厚樸酚+厚樸酚對(duì)照品貯備液5 mL、α-香附酮對(duì)照品貯備液2 mL，置于同一100 mL 量瓶中，甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液 丸劑切碎，每份約取6 g，精密稱定，加入適量硅藻土，研勻，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W、頻率40 kHz）處理1 h，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液 按處方工藝，制備缺陳皮、缺枳實(shí)、缺厚樸、缺香附的陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Welch Ultimate C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-0.3%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，20% A；5～15 min，20%～40%A；15～25 min，40%～74%A；25～37 min，74%A；37～38 min，74%～20%A；38～43 min，20%A）；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm（α-香附酮）、284 nm（橙皮苷）、290 nm（和厚樸酚、厚樸酚）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，供試品溶液色譜圖中有與對(duì)照品溶液4 種成分對(duì)應(yīng)的色譜峰，相鄰峰分離度均大于1.5，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下橙皮苷對(duì)照品貯備液4、2、1 mL，和厚樸酚+厚樸酚對(duì)照品貯備液4、2、1 mL，α-香附酮對(duì)照品貯備液2、1、0.5 mL，分別置于3 個(gè)10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5、2 mL，分別置于2 個(gè)10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，另取對(duì)照品溶液（未稀釋），以上6 種線性標(biāo)準(zhǔn)溶液在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，并以信噪比（S／N＝10）為定量限，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮峰面積RSD 分別為0.8%、1.1%、0.8%、0.6%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取丸劑（批號(hào)16015845）適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮含有量RSD 分別為1.5%、1.7%、1.8%、0.9%，表明該方法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)16015845）適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮峰面積RSD 分別為1.3%、1.1%、0.8%、0.9%，表明溶液在常溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取6 份各成分含量已知的丸劑（批號(hào)16015845，橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮含有量分別為2.346 8、0.104 6、0.202 2、0.038 2 mg／g），每份約3 g，精密稱定，適量硅藻土研勻后置于具塞錐形瓶中，精密加入“2.1.1”項(xiàng)下橙皮苷對(duì)照品貯備液5 mL、和厚樸酚+厚樸酚對(duì)照品貯備液1 mL、α-香附酮對(duì)照品貯備液0.5 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6 份，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.9 樣品含有量測(cè)定 取3 批丸劑，每批平行3份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含量有測(cè)定結(jié)果（mg／g，n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)參考各成分紫外光譜圖，選擇多通道檢測(cè)，于284 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)橙皮苷，290 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)和厚樸酚、厚樸酚，250 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)α-香附酮。甲醇（A）-0.3% 磷酸（B）等度洗脫（60∶40）時(shí)，橙皮苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度差，其他3 種成分出峰時(shí)間長(zhǎng)；梯度洗脫（0～20 min，20%～74% A；20～40 min，74%A）時(shí)，橙皮苷色譜峰保留時(shí)間約為7 min，與相鄰峰分離度差；梯度洗脫（0～5 min，20%A；5～15 min，20%～40%A；15～25 min，40%～74%A；25～37 min，74% A；37～38 min，74%～20%A；38～43 min，20%A）時(shí)，橙皮苷色譜峰保留時(shí)間約為9 min，與相鄰色譜峰分離度符合要求，其他3 種成分出峰時(shí)間適中，分離度良好。

3.2 色譜峰確認(rèn) 本實(shí)驗(yàn)以紫外光譜圖特征吸收波長(zhǎng)與特定波長(zhǎng)處吸收度比值作為成分色譜峰確認(rèn)依據(jù)，發(fā)現(xiàn)特定波長(zhǎng)處吸收度比值能很好地將相似度較高的紫外圖譜區(qū)分開(kāi)。其中，樣品溶液色譜圖中橙皮苷色譜峰保留時(shí)間約為12.8 min，其前后2個(gè)色譜峰分別為12.4、13.4 min，三者紫外光譜圖有較高的相似度，無(wú)法區(qū)分，均在284 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，248 nm 處有最小吸收，但橙皮苷色譜峰吸收度比值為7.970，其他2 個(gè)色譜峰依次為4.314、7.099，差異明顯，可以區(qū)分。

4 結(jié)論

隨著藥材種類、產(chǎn)地、代謝節(jié)律的影響［16］，有必要對(duì)小兒香橘丸主要藥效成分含有量進(jìn)行控制，而且它作為兒童用藥，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)更嚴(yán)格，含有量限度范圍不宜過(guò)寬。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定小兒香橘丸中橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮的含有量，并采用直接超聲提取，簡(jiǎn)便快速，專屬性好，可用于該制劑質(zhì)量控制。對(duì)同一廠家3 批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮含有量分別為2.346 8～2.547 0、0.098 2～0.104 6、0.193 0～0.202 2、0.031 9～0.038 2 mg／g，總體上較穩(wěn)定，但就含有量控制限度而言僅3 批遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，今后可考慮收集更多批次樣品以制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。