一測多評法同時(shí)測定寬中順氣丸中8 種成分

駱 航，李華生，王文淵

（永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南 永州 425100）

寬中順氣丸由香附（醋炙）、陳皮、莪術(shù)（醋炙）、三棱（麩炒）、木香、五靈脂（醋炙）、豬牙皂、黃芩、牽牛子、大黃、滑石11 味藥材組成，臨床上主要用于氣血郁滯、停食停水引起的胸膈痞滿、膨悶脹飽、不欲飲食、脘腹脹痛、大便秘結(jié)等病癥的治療［1］。方中香附（醋炙）疏肝解郁，理氣寬中，為君藥；輔以木香、陳皮行氣燥濕，健脾消食；五靈脂（醋炙）活血化瘀；莪術(shù)（醋炙）、三棱（麩炒）破血行氣，消積止痛；豬牙皂開竅散結(jié)；黃芩、大黃清熱燥濕，瀉下攻積；牽牛子、滑石利尿通淋，瀉水通便，引藥下行，諸藥合用，共奏順氣寬胸、消積化滯之功效［2］。

中藥及其制劑組成復(fù)雜，通過多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用而達(dá)到治療效果，單一成分檢測難以全面評價(jià)其整體質(zhì)量，多指標(biāo)成分評價(jià)模式已逐步應(yīng)用于相關(guān)質(zhì)量控制中，但傳統(tǒng)方法存在消耗大、檢驗(yàn)成本高、部分對照品質(zhì)量不穩(wěn)定并難以獲得等諸多不足。一測多評法利用中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，建立內(nèi)標(biāo)與其他成分之間的相對校正因子，僅使用1 種質(zhì)量穩(wěn)定、易于獲得、價(jià)格低廉的對照品，實(shí)現(xiàn)對中藥及其制劑中多指標(biāo)成分含有量的同時(shí)測定，正成為質(zhì)量評價(jià)新模式。本實(shí)驗(yàn)選擇寬中順氣丸中君藥香附（醋炙）所含香附烯酮、α-香附酮，臣藥陳皮所含橙皮苷、川陳皮素、桔皮素，佐藥莪術(shù)（醋炙）所含莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮作為指標(biāo)成分，建立一測多評法同時(shí)測定這8 種成分含有量，以期為完善和提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

Agilent 1100 型、Waters 2690 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；BP211DAG 型電子天平（德國Sartorius 公司）。吉馬酮（批號(hào)111665-201605，純度99.8%）、莪術(shù)二酮（批號(hào)111800-201302，純度99.8%）、橙皮苷（批號(hào)110721-201818，純度96.2%）、莪術(shù)醇（批號(hào)100185-201007，純度99.9%）、α-香附酮（批號(hào)110748-201815，純度99.7%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；桔皮素對照品（批號(hào)PRF8063048，純度98.7%）購自成都普思生物科技股份有限公司；川陳皮素（批號(hào)18030541，純度99.9%）、香附烯酮（批號(hào)18051522，純度95.5%）對照品均購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；木香、陳皮、香附（醋炙）、三棱（麩炒）、莪術(shù)（醋炙）、五靈脂（醋炙）、豬牙皂、黃芩、牽牛子、大黃、滑石均購自永州市永靛中藥飲片有限公司，經(jīng)永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院王文淵教授鑒定為正品，按各藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)均符合規(guī)定。寬中順氣丸（每100 粒重6 g，批號(hào)18080001、18080016、19010024）來源于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、香附烯酮、α-香附酮對照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.914、0.198、0.172、0.318、0.206、0.188、1.352、0.474 mg／mL 的貯備液，各精密吸取2.5 mL置于50 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（橙皮苷45.7 μg／mL、川陳皮素9.9 μg／mL、桔皮素8.6 μg／mL、莪術(shù)二酮15.9 μg／mL、莪術(shù)醇10.3 μg／mL、吉馬酮9.4 μg／mL、香附烯酮67.6 μg／mL、α-香附酮23.7 μg／mL）。

2.1.2 供試品溶液 取丸劑適量，研細(xì)，精密稱取2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，加熱回流提取60 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方比例和工藝，分別制備缺陳皮、缺莪術(shù)、缺香附的陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL／min；檢測波長326 nm（0～27.0 min，橙皮苷、川陳皮素、桔皮素）［3-5］、214 nm（27.0～45.0 min，莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮）［6-9］、242 nm（45.0～70.0 min，香附烯酮、α-香附酮）［10-11］；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1，可知各成分與相鄰色譜峰均能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按照各成分色譜峰計(jì)均不低于5 000，陰性無干擾。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對照品貯備液適量，甲醇制成25 倍質(zhì)量濃度差的6 個(gè)對照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、香附烯酮、α-香附酮峰面積RSD分別為0.66%、0.94%、1.15%、1.02%、1.05%、1.23%、0.58%、0.72%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丸劑，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、香附烯酮、α-香附酮含有量RSD 分別為1.01%、0.67%、1.35%、1.29%、1.46%、1.78%、0.92%、1.17%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、香附烯酮、α-香附酮峰面積RSD分別為0.59%、1.02%、1.18%、1.05%、1.12%、1.27%、0.53%、0.69%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批各成分含有量已知的丸劑適量，研細(xì)，精密稱取9 份，每份1.0 g，隨機(jī)分成3 組，每組3 份，置于具塞錐形瓶中，精密加入對照品溶液（橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、香附烯酮、α-香附酮質(zhì)量濃度分別為 0.678、0.144、0.098、0.182、0.136、0.112、0.938、0.322 mg／mL ）0.5、1.0、1.5 mL，使目標(biāo)成分加入量分別約為樣品原有量的50%、100%、150%，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、香附烯酮、α-香附酮平均加樣回收率（RSD）分別為98.32%（1.32%）、97.87%（1.63%）、96.93%（1.20%）、98.87%（0.99%）、98.52%（0.81%）、99.74%（0.97%）、100.00%（1.03%）、99.03%（1.11%）。

2.4 相對校正因子測定 取“2.3.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以吉馬酮為內(nèi)標(biāo)，測定其他7 種成分相對校正因子fk／m，公式為fk／m＝fk／fm＝（Wk×Am）／（Wm×Ak）（Wk為內(nèi)標(biāo)含有量，Ak為內(nèi)標(biāo)峰面積，Wm為待測成分含有量，Am為待測成分峰面積），結(jié)果見表3。

表3 各成分相對校正因子Tab.3 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性考察

2.5.1 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了Waters 2690、Agilent 1100 色譜儀，以及Agilent TC-C18、Diamonsil C18、Phenomenex C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對相對校正因子的影響，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

表4 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.2 不同體積流量對相對校正因子的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了不同體積流量（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL／min）對相對校正因子的影響，結(jié)果見表5，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

表5 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.5.3 不同柱溫對相對校正因子的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了不同柱溫（20、22、25、27、30 ℃）對相對校正因子的影響，結(jié)果見表6，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

2.6 色譜峰定位 本實(shí)驗(yàn)以吉馬酮為內(nèi)標(biāo)，采用相對保留時(shí)間法（待測成分與內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間之比）對其他成分色譜峰進(jìn)行定位，考察了“2.5.1”項(xiàng)下儀器、色譜柱對相對保留時(shí)間的影響，結(jié)果見表7，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

2.7 樣品含有量測定 取3 批丸劑，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備3 份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法和一測多評法計(jì)算含有量，結(jié)果見表8，可知2 種方法所得結(jié) 果接近［相對平均偏差（RAD）＜2.0%］。

表6 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.6 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表7 不同儀器、色譜柱對相對保留時(shí)間的影響Tab.7 Effects of different instruments and columns on relative retention time

表8 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g）Tab.8 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論

3.1 色譜峰定位方法確定 本實(shí)驗(yàn)曾采用保留時(shí)間差法對寬中順氣丸中各成分進(jìn)行定位，但發(fā)現(xiàn)不同儀器、色譜柱下其保留時(shí)間差差異較大，難以對色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確定位；相對保留時(shí)間值法所得結(jié)果穩(wěn)定，不同條件下其RSD 均小于2.0%，故最終確定采用該方法進(jìn)行色譜峰。

3.2 流動(dòng)相確定 本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水［6］、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1% 磷酸［8］、乙腈-0.1% 冰醋酸［3-5，12］、甲醇-水［7，10-11，13-14］流動(dòng)相體系，考察各成分峰形、分離度、色譜峰基線平穩(wěn)情況，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%冰醋酸洗脫時(shí)綜合效果最佳，再對其不斷進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，最終確定其作為流動(dòng)相，此時(shí)各成分色譜圖基線平穩(wěn)，峰形對稱，分離度符合規(guī)定。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次建立一測多評法同時(shí)測定寬中順氣丸中橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、香附烯酮、α-香附酮的含有量，再通過方法學(xué)考察、相對校正因子耐用性試驗(yàn)、色譜峰定位、與外標(biāo)法結(jié)果比較來驗(yàn)證其可行性。結(jié)果表明，該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于寬中順氣丸質(zhì)量控制，為全面評價(jià)該制劑質(zhì)量提供參考依據(jù)。