HPLC 法同時測定外感風(fēng)寒顆粒中10 種成分

曲頌揚(yáng)，關(guān) 開，周 慧，毛清雯

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847）

外感風(fēng)寒顆粒由桂枝、防風(fēng)、葛根、白芷、荊芥穗、羌活、柴胡、白芍、桔梗、炒苦杏仁、生姜、甘草12 味藥材組成，臨床上主要用于風(fēng)寒感冒、惡寒發(fā)熱、頭痛項強(qiáng)、全身酸疼、鼻塞流清涕、咳嗽、苔薄白、脈浮等病癥的治療［1］。方中桂枝、白芷、羌活發(fā)汗解表，祛風(fēng)散寒，共為君藥；輔以防風(fēng)、葛根、荊芥穗、生姜解肌退熱，溫肺止咳；炒苦杏仁、柴胡、桔梗、白芍祛痰止咳平喘，生津養(yǎng)血止痛；甘草緩急止痛，調(diào)和諸藥，諸藥合用，共奏解表散寒、退熱止咳之功效。

中藥及其制劑具有多成分、多靶點的特點，臨床療效為各成分協(xié)同作用的結(jié)果，單一成分檢測難以全面評價其質(zhì)量，近年來多指標(biāo)控制模式已逐步應(yīng)用于相關(guān)質(zhì)量控制中。外感風(fēng)寒顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2015 年版《中國藥典》 一部［1］，但僅對葛根素進(jìn)行了定量測定，未涉及方中君藥及其他藥味所含成分。本實驗參照中藥質(zhì)量標(biāo)志物以君藥為主，兼顧臣藥、佐藥、使藥的原則，選擇外感風(fēng)寒顆粒中君藥桂枝所含肉桂酸、桂皮醛，臣藥防風(fēng)所含升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷，葛根所含3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素，佐藥炒苦杏仁所含苦杏仁苷作為指標(biāo)成分，建立HPLC 法同時測定這10 種成分含有量，為全面評價該制劑質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BP-211D 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；KQ5200 型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

桂皮醛（批號110710-201821，純度99.6%）、肉桂酸（批號110786-201604，純度98.8%）、苦杏仁苷（批號110820-201808，純度88.2%）、葛根素（批號110752-201816，純度95.4%）、升麻素苷（批號111522-201712，純度96.2%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號111523-201811，純度97.4%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；3′-羥基葛根素（批號17051825，純度100.0%）、3′-甲氧基葛根素（批號17032021，純度99.8%）、升麻素（批號18042043，純度99.7%）、亥茅酚苷（批號17072821，純度99.5%）對照品均購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。外感風(fēng)寒顆粒［每袋裝 12 g（相當(dāng)于原藥材 12.5 g），批號18090401、18100201、19020602）］來源于華潤三九（臨清）藥業(yè)有限公司。桂枝、防風(fēng)、葛根、白芷、荊芥穗、羌活、柴胡、白芍、桔梗、炒苦杏仁、生姜、甘草均來源于沈陽中藥飲片藥業(yè)有限公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部曲頌揚(yáng)副主任中藥師鑒定為正品，符合2015 年版《中國藥典》 一部各藥材相關(guān)要求。乙腈為色譜純（德國Merck 公司）；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～11.0 min，9.0%A；11.0～17.0 min，9.0%～15.0%A；17.0～32.0 min，15.0%～26.0% A；32.0～50.0 min，26.0%～52.0% A；50.0～61.0 min，52.0%～60.0%A；61.0～70.0 min，60.0%～9.0% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長207 nm［1-3］（0～17.0 min，苦杏仁苷）、254 nm［1，4-10］（17.0～50.0 min，3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷）、280 nm［1，11-13］（50.0～70.0 min，肉桂酸、桂皮醛）；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇制成貯備液（苦杏仁苷2.718 mg／mL、3′-羥基葛根素1.152 mg／mL、葛根素3.438 mg／mL、3′-甲氧基葛根素0.974 mg／mL、升麻素苷2.932 mg／mL、升麻素 0.946 mg／mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷1.468 mg／mL、亥茅酚苷0.696 mg／mL、肉桂酸0.192 mg／mL、桂皮醛1.354 mg／mL），各精密量取2.5 mL，置于同一50 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得（苦杏仁苷135.9 μg／mL、3′-羥基葛根素57.6 μg／mL、葛根素171.9 μg／mL、3′-甲氧基葛根素48.7 μg／mL、升麻素苷146.6 μg／mL、升麻素47.3 μg／mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷73.4 μg／mL、亥茅酚苷 34.8 μg／mL、肉桂酸9.6 μg／mL、桂皮醛67.7 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取顆粒適量，剪開內(nèi)包裝，傾出內(nèi)容物后研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，精密加入25 mL 甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W、頻率40 kHz）處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下處方比例和工藝過程，分別制備缺苦杏仁、缺葛根、缺防風(fēng)、缺桂枝的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰基線平穩(wěn)，均能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于4 500，陰性無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品貯備液各2.0 mL，置于25 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量，甲醇依次稀釋2、5、10、15、20 倍，制成系列質(zhì)量濃度對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗 取同一供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得苦杏仁苷、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、肉桂酸、桂皮醛峰面積RSD 分別為0.68%、1.13%、0.55%、1.22%、0.71%、1.06%、0.87%、1.31%、1.49%、1.23%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取顆粒適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得苦杏仁苷、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、肉桂酸、桂皮醛含有量RSD 分別為1.08%、1.30%、0.99%、1.46%、1.19%、1.52%、1.25%、1.74%、1.81%、1.63%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、10、16、24 h 在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得苦杏仁苷、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、肉桂酸、桂皮醛峰面積RSD 分別為0.71%、1.06%、0.58%、1.19%、0.69%、1.03%、0.90%、1.33%、1.47%、1.24%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取各成分含有量已知的顆粒（批號18090401）9 份，研細(xì)，3 份為1 組，每份約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入對照品溶液（苦杏仁苷1.528 mg／mL、3′-羥基葛根素0.654 mg／mL、葛根素1.968 mg／mL、3′-甲氧基葛根素 0.532 mg／mL、升麻素苷1.746 mg／mL、升麻素0.522 mg／mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.838 mg／mL、亥茅酚苷0.396 mg／mL、肉桂酸0.108 mg／mL、桂皮醛0.782 mg／mL）0.5、1.0、1.5 mL 各3 份（約分別相當(dāng)于樣品含的50%、100%、150%），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，苦杏仁苷、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、肉桂酸、桂皮醛平均加樣回收率分別為99.46%、98.03%、100.08%、98.54%、99.89%、97.37%、97.89%、96.97%、97.09%、100.00%，RSD 分別為0.96%、1.22%、0.80%、1.37%、0.73%、1.10%、1.45%、0.86%、1.09%、0.95%。

2.4 樣品含有量測定 取3 批顆粒（批號18090401、18100201、19020602），研細(xì)，各取約2.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項方法平行制備3份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 討論

3.1 流動相選擇 本實驗考察了乙腈-水［1］、甲醇-水［1，7-8］，發(fā)現(xiàn)兩者均出現(xiàn)不同程度基線漂移，部分待測成分分離不完全，前者相對效果較佳?？紤]到磷酸能平穩(wěn)基線，改善峰形，故又采用乙腈-磷酸［1-3，5，11，14］進(jìn)行梯度洗脫。通過對磷酸體積分?jǐn)?shù)和洗脫比例不斷進(jìn)行摸索，最終確定乙腈-0.1%磷酸作為流動相，按“2.1”項下比例洗脫，此時各成分色譜圖基線平穩(wěn)，峰形良好，分離效果理想。

3.2 供試品溶液制備方法選擇 本實驗考察了提取溶劑（甲醇［1，4，7-12］、70% 甲醇、70% 乙醇［2，5］、30%乙醇［1，6］）、提取方式（加熱回流［1-2，4-8］、超聲［1，11-12］），發(fā)現(xiàn)甲醇提取效果優(yōu)于其他溶劑，超聲、加熱回流提取率差異不大，可能與各藥材均經(jīng)提取濃縮后制成顆粒有關(guān)，同時還考察了提取時間（15、30、45 min）。最終，確定甲醇超聲提取30 min作為供試品溶液制備方法。

4 結(jié)論

本實驗首次采用HPLC 法同時測定外感風(fēng)寒顆粒中苦杏仁苷、3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、肉桂酸、桂皮醛的含有量，該方法操作簡便，準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)，可為該制劑質(zhì)量控制提供參考依據(jù)，有助于方中原藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及制劑生產(chǎn)工藝參數(shù)的不斷細(xì)化，以確保其質(zhì)量穩(wěn)定性和療效一致性。