纖維素酶輔助提取藕節(jié)多糖工藝優(yōu)化及其動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)研究

王占一，趙 靜，朱天順，胡錦鋼，趙春林，向 蘭

（1.棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東 棗莊 277160；2.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012）

蓮Nelumbo nuciferaGaertn.為睡蓮科蓮屬水生植物，其干燥根莖節(jié)部入藥，稱為藕節(jié)，2015 年版《中國(guó)藥典》 也有收載［1］，具有收斂止血、清熱涼血、通便止瀉、健脾益氣之功效，用于治療肺結(jié)核咯血、胃出血、鼻出血、吐血、便血等病癥。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)藕節(jié)中含有大量多酚、生物堿、多糖，其中多糖類成分已引起廣泛關(guān)注［2-3］。

在天然活性成分的提取過程中，水酶法提取是將生物酶作為一種生物催化劑來破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞膜、細(xì)胞壁通透性，降低底物傳質(zhì)阻力，加快細(xì)胞中活性物質(zhì)溶出，該方法操作安全，易于控制，提取效率高，已在生產(chǎn)實(shí)踐中得到大量應(yīng)用［4-9］。

天然活性成分從實(shí)驗(yàn)材料到提取介質(zhì)中的溶出過程比較復(fù)雜，會(huì)受到各種因素的影響，但其本質(zhì)都是溶質(zhì)從物料的固相到溶劑的液相轉(zhuǎn)運(yùn)過程。一般認(rèn)為，有效成分從物料內(nèi)部到物料表面擴(kuò)散的過程是控制該步驟的關(guān)鍵［10］，但纖維素酶法提取多糖類成分時(shí)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程的動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶輔助提取藕節(jié)多糖工藝，通過Fick 擴(kuò)散公式、Van’t Hoff 方程分析該成分從材料固相到溶劑液相傳遞過程中的動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考，也為藥材資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

藕采自微山湖，手工取其根莖節(jié)部后洗凈、烘干，經(jīng)棗莊學(xué)院閆志佩教授鑒定為正品。TU-1800SPC 型紫外-可見分光光度計(jì)（上海普析通用儀器有限公司）；ALC-1104 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；GZX-9240MBE 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）。葡萄糖對(duì)照品（純度＞98%，批號(hào)110833-201805）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；纖維素酶（酶活性≥20 000 U／g）購(gòu)自鄭州宇控生物科技有限公司。3，5-二硝基水楊酸、無水乙醇、碳酸鈉、濃硫酸、苯酚、抗壞血酸、磷酸鹽等試劑均為分析純，購(gòu)自天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含有量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法［11-12］測(cè)定總糖含有量。將D-無水葡萄糖干燥至恒重后精密稱取50 mg，小燒杯溶解，置于容量瓶中定容至100 mL，作為葡萄糖貯備液，依次稀釋成10、20、30、40、50、60、70 μg／mL，以蒸餾水為對(duì)照，各量取1 mL 置于10 mL 具塞試管中，加入5%苯酚溶液0.5 mL，充分振搖后再滴加5.5 mL 濃硫酸，混合均勻，室溫下靜置30 min，于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.079 2X-0.005 5（r＝0.999 5），在1.43～10 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

采用DNS 顯色法［13-14］測(cè)定還原糖含有量。精密量取0.5 mg／mL 葡萄糖溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于試管中，蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，加入2.0 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS）顯色劑，沸水浴5 min，冷卻，蒸餾水補(bǔ)至10 mL 后于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.017 2X-0.186 2（r＝0.999 3），在5～50 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

再計(jì)算總糖含有量與還原糖含有量的差值，即為多糖含有量。

2.2 多糖得率測(cè)定 精密稱取粉碎至40 目的藕節(jié)粉末5.0 g，置于三頸圓底燒瓶中，加入纖維素酶至設(shè)定加酶量，加入一定pH 值磷酸鹽緩沖液使料液比達(dá)到設(shè)定值，酶解反應(yīng)到設(shè)定時(shí)間，其間溫度保持恒定。提取結(jié)束后，將提取物轉(zhuǎn)移至燒杯中，沸水浴滅酶10 min，抽濾，定容至250 mL，作為供試品溶液，計(jì)算多糖得率，公式為多糖得率＝（多糖含有量／藥材質(zhì)量）×100%。

2.3 單因素試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)考察了加酶量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、料液比（1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28）、介質(zhì)pH（2、3、4、5、6、7）、酶解溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）、酶解時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）對(duì)多糖得率的影響，將其中1 個(gè)作為單因素時(shí)，其他4 個(gè)分別固定為加酶量0.8%、料液比1∶20、介質(zhì)pH 5、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間2.5 h。

2.3.1 加酶量 圖1 顯示，當(dāng)加酶量為0.2%～0.8%時(shí)，多糖得率隨著其增加而升高；超過0.8%后，逐漸趨于平緩，表明已達(dá)到飽和狀態(tài)，考慮到生產(chǎn)成本，確定加酶量在0.8%左右。

圖1 加酶量對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme consumption on polysaccharides yield

2.3.2 料液比 圖2 顯示，隨著提取溶劑用量增加，多糖得率呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)達(dá)到最大值，其原因是提取溶劑用量較大時(shí)有利于溶質(zhì)從固相向溶劑相轉(zhuǎn)移，加速多糖溶出，得率也隨之提高；超過1∶20 后，由于后期處理過程中有損耗，導(dǎo)致多糖得率不升反降，故確定料液比在1∶20 左右。

圖2 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides yield

2.3.3 介質(zhì)pH 圖3 顯示，隨著介質(zhì)pH 升高，多糖得率呈先升后降的趨勢(shì)，在5 時(shí)達(dá)到最大值，其原因是磷酸鹽緩沖液pH 值對(duì)生物酶的影響較大，大于或小于最適pH 值都會(huì)降低后者活性，故選擇介質(zhì)pH 在5 左右。

圖3 介質(zhì)pH 對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of medium pH on polysaccharides yield

2.3.4 酶解溫度 圖4 顯示，當(dāng)酶解溫度為20～50 ℃時(shí)，多糖得率隨著其增加而逐漸升高，在50 ℃時(shí)達(dá)到最大值；超過50 ℃后，多糖得率呈降低趨勢(shì)，其原因是酶解溫度過高時(shí)生物酶活性受到抑制，不能充分發(fā)揮作用，導(dǎo)致其得率降低，故確定酶解溫度在50 ℃左右。

圖4 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on polysaccharides yield

2.3.5 酶解時(shí)間 圖5 顯示，當(dāng)酶解時(shí)間為1.0～2.5 h 時(shí)，多糖得率隨著其延長(zhǎng)而逐漸升高，在2.5 h 達(dá)到最大值；超過2.5 h 后，多糖得率幾乎不再提高，考慮到實(shí)際生產(chǎn)，確定酶解時(shí)間在2.5 h左右。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on polysaccharides yield

2.4 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design Expert 8.0.5 軟件進(jìn)行Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)，選擇加酶量（X1）、介質(zhì)pH（X2）、酶解溫度（X3）、酶解時(shí)間（X4）作為影響因素，多糖得率（Y）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，共設(shè)立29個(gè)處理組，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

通過Design-Expert 8.0.5 軟件進(jìn)行擬合，得二次回歸方程為Y＝5.68+0.61X1-0.062X2-0.13X3+0.27X4+0.24X1X2-0.43X1X3-0.36X1X4-0.07X2X3+0.16X2X4-0.38X3X4--0.64，方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.000 1，決定系數(shù)R2＝0.909 5，失擬項(xiàng)P＞0.05，表明方程擬合情況良好；X1、對(duì)多糖得率有極顯著影響（P＜0.01），X4、X1X3、X3X4對(duì)其有顯著影響（P＜0.05）；各因素影響程度依次為加酶量＞酶解時(shí)間＞酶解溫度＞介質(zhì)pH。響應(yīng)面分析見圖6。

由此可知，最優(yōu)提取工藝為加酶量0.9%，介質(zhì)pH 5.07，酶解溫度47.4 ℃，酶解時(shí)間2.58 h，多糖得率為5.87%，考慮到實(shí)際操作，將其修正為加酶量0.9%，介質(zhì)pH 5.0，酶解溫度47 ℃，酶解時(shí)間2.5 h。進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得多糖平均得率為5.86%，與預(yù)測(cè)值5.87% 接近，表明工藝穩(wěn)定可靠。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

圖6 各因素響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for various factors

2.5 提取過程動(dòng)力學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)假設(shè)整個(gè)提取體系溫度分布一致，攪拌良好，忽略傳質(zhì)過程中的外部阻力，將原料粉末近似看作球形構(gòu)造，表面光滑。多糖從固相向溶劑相的溶出只與徑向相關(guān)，擴(kuò)散速率通常用Fick 擴(kuò)散公式描述［15］，為了方便表達(dá)，假設(shè)Y＝ln ［C∞／（C∞-C）］，完整表達(dá)為Y＝kt+ln［π2C∞／6（C∞-C0）］且k＝π2DS／r2（C∞為傳質(zhì)達(dá)到平衡時(shí)介質(zhì)中多糖含有量，單位mg／mL；C為t時(shí)刻介質(zhì)中多糖含有量，單位mg／mL；C0為介質(zhì)中多糖初始含有量，單位mg／mL；k為提取速率常數(shù)，單位min-1；DS為表面擴(kuò)散系數(shù)，單位cm2／min；r為近似球形的材料半徑，單位cm）。

精密稱取40 g 藕節(jié)粉末（r約為0.05 cm），設(shè)定纖維素酶加入量0.9%，介質(zhì)pH 5，料液比1∶20，在7 種溫度（305、310、315、320、325、330、335 K）下水浴提取，相同條件下另設(shè)不加纖維素酶的體系。從開始反應(yīng)的0.5 h 開始，每隔0.25 h 取樣0.5 mL，直至3.5 h 提取完全為止，測(cè)定提取樣品中多糖含有量，得到多糖得率隨提取時(shí)間的變化規(guī)律，結(jié)果見圖7。

由此可知，無論是否加入纖維素酶，多糖得率都隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)而升高；在最適酶解溫度下，加入纖維素酶后多糖得率最高，提取過程達(dá)到平衡時(shí)間最短，其原因是纖維素酶有其最佳酶解溫度，低于或者超過該溫度時(shí)活性均會(huì)受到限制，導(dǎo)致其得率下降，達(dá)到提取平衡時(shí)間延長(zhǎng)；但在各提取溫度下，加入纖維素酶后多糖得率均高于未加入纖維素酶，表明纖維素酶有助于提高其得率。提取過程動(dòng)力學(xué)方程（X為提取時(shí)間，Y為多糖得率）及動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表4。

圖7 不同溫度下多糖得率與提取時(shí)間的關(guān)系Fig.7 Relationships between polysaccharides yield and extraction time under different temperatures

表4 提取過程動(dòng)力學(xué)方程及動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.4 Kinetic equations and kinetic parameters for extraction process

由此可知，在不同提取溫度下無論是否加入纖維素酶，決定系數(shù)R2均不小于0.901 3，表明方程擬合情況良好，提取過程符合一級(jí)傳質(zhì)動(dòng)力學(xué)模型；加入纖維素酶后，在提取溫度305～335 K 范圍內(nèi)提取速率常數(shù)（k）先升后降，在320 K 達(dá)到最大值，證實(shí)將其作為最佳酶解溫度時(shí)既可保證較好的提取效果，又能達(dá)到節(jié)約資源的目的；相同提取溫度下加入纖維素酶后的k值均大于未加入纖維素酶，表面擴(kuò)散系數(shù)（DS）亦然。

2.6 提取過程熱力學(xué)分析 當(dāng)提取過程達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，可通過Van’t Hoff 方程計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS、ΔG［16-17］，計(jì)算公式為ln（C／C∞-C）＝-ΔG／RT＝-ΔH／RT+ΔS／R［ΔG為提取過程的自由能，單位kJ／mol；ΔS為提取過程的熵，單位J／（mol·K）；ΔH為提取過程的焓，單位kJ／mol；R為摩爾氣體常數(shù)，數(shù)值8.314 J／（mol·K）；T為提取溫度，單位K］。

加入纖維素酶后，在提取溫度320 K 時(shí)多糖提取達(dá)到平衡，即C＝C∞，將ln ［C／（C∞-C）］對(duì)1／T作線性擬合，可得2 組線性方程，即ln ［C／（C∞-C）］＝-7.841 3X+0.029 8（R2＝0.988 1）、ln ［C／（C∞-C）］＝15.468 8X-0.042 3（R2＝0.987 3），由此計(jì)算ΔH、ΔS、ΔG。由于提取溫度320 K 時(shí)ln ［C／（C∞-C）］無意義，故只計(jì)算305、310、315、325、330、335 K 下熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表5。

表5 不同提取溫度下熱力學(xué)參數(shù)Tab.5 Thermodynamic parameters under different extraction temperatures

由此可知，提取溫度為305～315 K 時(shí)，ΔH、ΔS均大于0，表明提取過程中吸熱熵增加［17］；為325～335 K 時(shí)，ΔH、ΔS均小于0，表明提取過程中放熱熵減?。徊煌崛囟认娄均小于0，表明提取過程為自發(fā)過程，其中在320 K 前ΔG值減小，表明提取過程容易進(jìn)行［17］，而超過320 K 后ΔG值反而增大，表明提取過程不容易進(jìn)行，從而印證了最佳提取溫度確定為320 K（47 ℃）的合理性。

3 討論

水酶法是在機(jī)械破碎的基礎(chǔ)上，利用酶（蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等）破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，提高植物細(xì)胞膜、細(xì)胞壁通透性，加快內(nèi)容物溶解，從而增加提取效率、產(chǎn)物得率。文獻(xiàn)報(bào)道，采用該方法提取油橄欖葉［18］、菊苣根［19］、半邊蓮［20］等藥材中的多糖時(shí)得率高，安全可控。本實(shí)驗(yàn)通過纖維素酶法輔助提取藕節(jié)多糖，并結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)可行性和成本應(yīng)用Box-Behnken 響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)所建立的模型穩(wěn)定可靠。

目前，已有關(guān)于天然產(chǎn)物提取過程中動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)的研究［10，16-17］，天然活性成分從實(shí)驗(yàn)材料中的溶出過程比較復(fù)雜，會(huì)受到有效成分分子量大小、藥材粉末顆粒形態(tài)、藥材質(zhì)地、細(xì)胞破碎程度等諸多因素的影響［10］，但有效成分向外擴(kuò)散過程是關(guān)鍵。因此，本實(shí)驗(yàn)采用Fick 擴(kuò)散公式、Van’t Hoff 方程分析有效成分向外擴(kuò)散過程的動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)，發(fā)現(xiàn)纖維素酶能提高藕節(jié)多糖提取過程中提取速率常數(shù)（k）、表面擴(kuò)散系數(shù)（DS），從而加快溶出速率。另外，纖維素酶法提取天然活性成分時(shí)，應(yīng)在其最適溫度下進(jìn)行，這樣才能充分發(fā)揮生物酶的高效性。