新補(bǔ)骨脂異黃酮在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及組織分布研究

張志超，王小康，潘遠(yuǎn)安，劉江紅

（深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 深圳 518110）

新補(bǔ)骨脂異黃酮是補(bǔ)骨脂Psoralea corylifolialL.中常見的黃酮類化合物［1］，有著抗氧化［2-3］、抗菌［3］、抗炎［4］、神經(jīng)保護(hù)［5］、抗骨質(zhì)疏松［6-7］、抗前列腺癌［8］等作用。課題組前期發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂對(duì)大鼠具有很強(qiáng)的肝毒性和腎毒性，與文獻(xiàn)［9-10］報(bào)道一致，故研究該藥材所含新補(bǔ)骨脂異黃酮的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及組織分布時(shí)，有助于了解其體內(nèi)代謝途徑、組織蓄積情況、藥理活性、毒性機(jī)制。

目前，對(duì)新補(bǔ)骨脂異黃酮的研究主要集中在大鼠給予補(bǔ)骨脂后它在血漿中的藥動(dòng)學(xué)和腦組織中的組織分布［11-13］，尚無單獨(dú)給予該成分后的相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期報(bào)道基礎(chǔ)上，建立超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）法測(cè)定大鼠血清及各組織中新補(bǔ)骨脂異黃酮含有量，并研究該成分體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和組織分布，為后期相關(guān)體內(nèi)作用機(jī)制考察提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITYTMH-class 型超高效液相色譜儀、Waters SYNAPTTMG2 TQD 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、MasslynxTM4.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Waters 公司）；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；QL-861 型微型旋渦混合儀（江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；BP211D 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Anke TGL-16G-A 型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；UV-1800 型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；DKZ-450B 型電熱恒溫振蕩水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；MTN-2800D 型氮?dú)獯蹈蓛x（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 新補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)照品（純度≥99%，批號(hào)SH-YY0908）購(gòu)自上海一研生物科技有限公司；芒柄花黃素對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)JD-65914）購(gòu)自上海晶都生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈、甲酸、水均為色譜純；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）-2018-0002，飼養(yǎng)于恒溫［（25±2）℃］、恒濕［相對(duì)濕度（55±10）%］動(dòng)物室，每天12 h亮／暗交替，自由飲水進(jìn)食。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取新補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)照品適量，置于10 mL 棕色量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成25.0 mg／mL 貯備液，甲醇再進(jìn)一步稀釋，即得（質(zhì)量濃度分別為5.0、50.0、250.0、500.0 μg／mL），現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取芒柄花黃素對(duì)照品適量，甲醇配制成50 μg／mL 貯備液，再用甲醇進(jìn)一步稀釋，即得（質(zhì)量濃度為500 ng／mL），現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.3 含藥生理鹽水 取適量新補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)照品，加適量生理鹽水超聲處理至溶解，即得（質(zhì)量濃度為50 mg／mL），現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 UPLC-MS／MS 分析

2.2.1 色譜條件 Waters ACQUITYTMBEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相水（含0.1%甲酸）（A）-乙腈（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫（0～9.0 min，2%～36%B；9.0～10.5 min，36%～48% B；10.5～12.5 min，48%～80% B；12.5～13.5 min，80%～100% B；13.5～14.0 min，100%B；14.0～15.0 min，100%～2% B；15.0～16.0 min，2% B）；體積流量0.4 mL／min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源ESI（正離子），毛細(xì)管電壓3.3 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣、錐孔反吹氣氮?dú)?，體積流量800、50 L／h；掃描方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；新補(bǔ)骨脂異黃酮檢測(cè)離子m／z323.4～267.2，錐孔電壓48 eV，碰撞能量20 eV；內(nèi)標(biāo)（芒柄花黃素）檢測(cè)離子m／z269.1～253.1，碎裂電壓50 eV，碰撞能量30 eV。

2.3 樣本前處理 取組織樣本1 g，加入3 mL 0.9%NaCl 溶液進(jìn)行勻漿。取血清或組織勻漿樣品100 μL，加入100 μL 500 ng／mL 內(nèi)標(biāo)（芒柄花黃素）溶液，充分混勻后加入300 μL 沉淀劑（乙腈）渦旋1 min，10 000 r／min 離心5 min，取上清液，氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?0%甲醇復(fù)溶，進(jìn)行UPLCMS／MS 分析。

2.4 大鼠藥動(dòng)學(xué)、組織分布研究 取18 只SD 大鼠，隨機(jī)分為3 組，每組6 只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，并從頸外靜脈抽取空白血液。3 組大鼠分別口服50、100、200 mg／kg 含藥生理鹽水后，于0.5、1、2、4、6、8、10、24、48 h 采集血液，置于EP 管中，室溫下放置2 h 后10 000 r／min 離心10 min，吸取上層血清，于-80 ℃下保存。另取24 只SD 大鼠，隨機(jī)分為4 組，每組6 只，隨機(jī)選取1 組作為空白組，其余3 組口服100 mg／kg 含藥生理鹽水，分別于0.5、2、8 h 后腹腔注射水合氯醛麻醉，立即處死，取腎臟、肝臟、小腸，0.9%NaCl 溶液洗滌至無血色，濾紙吸干，置于EP 管中，液氮速凍15 min，于-80 ℃下保存。

2.5 數(shù)據(jù)處理 通過Winnonlin 6.3 軟件進(jìn)行分析，采用非房室模型計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，其中tmax、t1／2、MRT0～t等參數(shù)經(jīng)SPSS 軟件進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 專屬性考察 取空白血清和組織、空白血清和組織+新補(bǔ)骨脂異黃酮或內(nèi)標(biāo)（芒柄花黃素）、給藥0.5 h 后血清和組織，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1～2。由此可知，新補(bǔ)骨脂異黃酮、內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰形良好，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。

圖1 大鼠血清和組織中新補(bǔ)骨脂異黃酮MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of neobavaisoflavone in rat serum and tissues

圖2 大鼠血清和組織中內(nèi)標(biāo)（芒柄花黃素）MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of internal standard（formononetin）in rat serum and tissues

3.2 線性關(guān)系考察 取適量空白血清或空白組織勻漿液，加入“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，制成含4.0、10.0、20.0、50.0、100.0、300.0、700.0 ng／mL新補(bǔ)骨脂異黃酮的相應(yīng)樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理（除了不加60%甲醇外），在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以新補(bǔ)骨脂異黃酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），新補(bǔ)骨脂異黃酮與內(nèi)標(biāo)峰面積比值乘以內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，并以信噪比（S／N）＝10 為定量限，結(jié)果見表1，可知新補(bǔ)骨脂異黃酮在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法靈敏度較高，可用于微量分析。

表1 大鼠血清和組織中新補(bǔ)骨脂異黃酮線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of neobavaisoflavone in rat serum and tissues

3.3 基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率試驗(yàn) 取5 只SD 大鼠空白血清、空白組織勻漿液各100 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理（除了用甲醇代替內(nèi)標(biāo)溶液外），殘?jiān)谩?.1.1”項(xiàng)下12.5、25.0、450 ng／mL 對(duì)照品溶液各100 μL 溶解，平行5 份，氮?dú)獯蹈珊?0%甲醇復(fù)溶，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得到峰面積A1；取相應(yīng)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液于EP 管中，加空白血清、空白組織勻漿液混勻，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，平行5 份，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得到峰面積A2；取相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液于EP 管中，氮?dú)獯蹈珊髿堅(jiān)?00 μL 純水復(fù)溶，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得到峰面積A3，以A1與A3的比值為基質(zhì)效應(yīng)，A2與A1的比值為提取回收率，結(jié)果見表2，可知該方法基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率良好，符合生物樣品檢測(cè)要求。

表2 大鼠血清和組織中新補(bǔ)骨脂異黃酮基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab.2 Results of matrix effect and extraction recovery tests for neobavaisoflavone in rat serum and tissues（n＝5）

3.4 準(zhǔn)確度、精密度試驗(yàn) 空白血清、空白組織勻漿液制成12.5、25.0、450.0 ng／mL 樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，平行6 份，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定5 d，結(jié)果見表3，可知該方法準(zhǔn)確度、精密度良好，符合生物樣品檢測(cè)要求。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 空白血清、空白組織勻漿液制成12.5、450.0 ng／mL 樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，平行3 份，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別考察經(jīng)3 次冷凍-解凍循環(huán)、前處理后放置24 h、-80 ℃放置3 個(gè)月后的穩(wěn)定性，結(jié)果見表4，可知該方法穩(wěn)定性良好，符合生物樣品檢測(cè)要求。

3.6 藥動(dòng)學(xué)研究 大鼠口服給藥后繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，再經(jīng)非室模型統(tǒng)計(jì)矩計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，見表5、圖3。由此可知，100、200 mg／kg 新補(bǔ)骨脂異黃酮t1／2、tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞、MRT0～t、MRT0～∞高于50 mg／kg（P＜0.05），以200 mg／kg 更明顯（P＜0.05）。

表3 大鼠血清和組織中新補(bǔ)骨脂異黃酮準(zhǔn)確度、精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab.3 Results of accuracy and precision tests for neobavaisoflavone in rat serum and tissues（n＝5）

表4 大鼠血清和組織中新補(bǔ)骨脂異黃酮穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.4 Results of stability tests for neobavaisoflavone in rat serum and tissues（n＝3）

表5 新補(bǔ)骨脂異黃酮主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for neobavaisoflavone（±s，n＝6）

表5 新補(bǔ)骨脂異黃酮主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for neobavaisoflavone（±s，n＝6）

注：與50 mg／kg 比較，?P＜0.05；與100 mg／kg 比較，#P＜0.05。

圖3 不同質(zhì)量濃度新補(bǔ)骨脂異黃酮血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.3 Plasma concentration-time curves for different concentrations of neobavaisoflavone

3.7 組織分布研究 大鼠口服給予新補(bǔ)骨脂異黃酮后，測(cè)定該成分在0.5、2、8 h 的組織分布，結(jié)果見圖4。由此可知，不同時(shí)間點(diǎn)各組織中新補(bǔ)骨脂異黃酮含有量依次為腎＞肝＞小腸。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS／MS 法，在16 min 內(nèi)對(duì)新補(bǔ)骨脂異黃酮進(jìn)行定量分析，具有快速靈敏、選擇性好、專屬性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可為研究該成分藥動(dòng)學(xué)及組織分布提供依據(jù)，也有利于闡明其作用機(jī)制。課題組前期采用文獻(xiàn)［11］報(bào)道的LC-MS／MS 法測(cè)定血漿中新補(bǔ)骨脂異黃酮含有量，發(fā)現(xiàn)其流動(dòng)相組成與本實(shí)驗(yàn)基本相同，均為乙腈-水等度洗脫，但該方法在檢測(cè)組織樣本時(shí)基線高，目標(biāo)化合物響應(yīng)低，故又在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸，可顯著改善峰形，降低基線，提高響應(yīng)值。

圖4 大鼠組織中新補(bǔ)骨脂異黃酮含有量Fig.4 Neobavaisoflavone contents in rat tissues

結(jié)果顯示，大鼠給予50 mg／kg 新補(bǔ)骨脂異黃酮后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與給予100、200 mg／kg 比較具有顯著差異，表明該成分在大鼠體內(nèi)的吸收、分布、消除存在一定劑量依賴性，但不同劑量之間基本呈非線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)選擇中間劑量100 mg／kg，并以吸收相、分布相、消除相各1 個(gè)時(shí)間點(diǎn)為組織分布取樣時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)大鼠給藥后新補(bǔ)骨脂異黃酮含有量在腎、肝中較高，維持時(shí)間較長(zhǎng)，即在這2個(gè)部位存在藥物蓄積現(xiàn)象，可能與補(bǔ)骨脂對(duì)大鼠具有肝毒性和腎毒性有關(guān)［14-15］。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在大鼠心、腦、肌肉中未檢測(cè)到新補(bǔ)骨脂異黃酮，推測(cè)該成分可能對(duì)組織分布具有一定的靶向性，需要作進(jìn)一步研究。