茯苓四逆湯對老年膿毒癥大鼠心肌損傷的保護(hù)作用

王評 彭曉洪 黃永蓮 黃亞秀 李少萍 陳冬杰 胡世平

(深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518172)

膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房患者的主要死亡原因〔1〕。受基礎(chǔ)病、免疫力低下等因素影響，老年人較青壯年更易發(fā)生膿毒癥，且預(yù)后更差〔2〕。膿毒癥易繼發(fā)心肌損傷，心肌損傷越重，膿毒癥死亡率越高，兩者呈顯著正相關(guān)〔3〕。目前多認(rèn)為Toll樣受體(TLR)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與膿毒癥心肌損傷相關(guān)，其下游信號通路中核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6等促炎因子在發(fā)病過程中起重要作用〔4,5〕。心型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)是新發(fā)現(xiàn)的極早期診斷心肌損傷的標(biāo)志物，具有很高的特異性、敏感性，能獨(dú)立預(yù)測膿毒癥心肌損傷的預(yù)后〔6〕。前期研究發(fā)現(xiàn)茯苓四逆湯能減輕慢性心力衰竭患者炎癥反應(yīng)、改善心功能〔7〕。本研究觀察茯苓四逆湯對老年膿毒癥大鼠血清TNF-α、IL-6濃度及心肌細(xì)胞NF-κB、H-FABP蛋白表達(dá)的影響，探討茯苓四逆湯對老年膿毒癥大鼠心肌損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動物 115只20月齡SPF級雄性SD大鼠，體重(350±30)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司〔許可證號：SCXK(滬)2017-0006〕。動物實(shí)驗(yàn)通過醫(yī)院倫理審查，所有大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.2主要儀器 Fresco D-37520離心機(jī)(賽默飛)；ADVIA240全自動生化分析儀(西門子)；165-8001電泳槽(BIO-RAD)；164-5050電泳儀(BIO-RAD)；170-3930轉(zhuǎn)印槽(BIO-RAD)；TS-1000水平脫色搖床(海門其林貝爾)；MultiSkan3酶標(biāo)儀(Thermo)；Pro 200精密組織勻漿器(Pro Scientific)等。

1.3試劑 大鼠TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海美軒生物科技有限公司，貨號分別為MEXN-R0019、MEXN-R0015)；Western印跡試劑:兔抗大鼠NF-κB抗體、兔抗大鼠H-FABP抗體及內(nèi)參Gapdh單抗(Abcam，英國，貨號分別為AB32536、AB45966、Ab8245)，二抗、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)等。茯苓四逆湯(茯苓30 g、熟附子10 g、人參5 g、干姜8 g、炙甘草10 g)由醫(yī)院藥劑科提供(深圳市正皇莊中藥飲片有限公司配送)，濃煎成含原生藥1 g/ml，過濾除菌分裝4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4分組及造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為6組：正常組15只，假手術(shù)組、模型組、茯苓四逆湯低、中、高劑量組各20只。參考文獻(xiàn)〔8〕采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備膿毒癥模型：術(shù)前12 h禁食，自由飲水。腹腔注射0.4 ml/kg 10%水合氯醛麻醉，腹部備皮消毒，全身75%酒精擦拭消毒后放入超凈工作臺并固定于手術(shù)臺。沿劍突下約2 cm處沿腹正中線剪開腹壁約1 cm，找出盲腸，用5號線結(jié)扎約1/3盲腸，用18G針頭貫通穿刺結(jié)扎部位的盲腸2次，輕輕擠壓使少量腸內(nèi)容物溢出，將處理好的盲腸回納腹腔，縫合腹腔。術(shù)畢予頸后皮下注射10 ml生理鹽水液體復(fù)蘇，同時(shí)將大鼠置于37℃加熱板上等待蘇醒。假手術(shù)組開腹，除盲腸結(jié)扎及穿刺，余同模型組。正常組不進(jìn)行麻醉及開腹手術(shù)。

1.5給藥方法 大鼠蘇醒后自由飲水正常進(jìn)食，單獨(dú)飼養(yǎng)。茯苓四逆湯灌胃劑量參照血清藥理學(xué)等效劑量換算公式進(jìn)行換算〔9〕，350 g大鼠的等效劑量折算為2.1 g，低、中、高劑量分別為1倍(2.1 g/d)、2倍(4.2 g/d)、3倍(6.3 g/d)，用生理鹽水稀釋至10 ml，造模后6 h開始灌胃，每日劑量分2次給藥，持續(xù)3 d，正常組、假手術(shù)組及模型組相同時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水灌胃。

1.6觀察指標(biāo) 每天觀察大鼠的生存狀態(tài)和生存時(shí)間、死亡數(shù)。各組于造模后24 h、48 h、72 h分別隨機(jī)取5只處死收集尾靜脈血，離心分離血清后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測TNF-α、IL-6含量，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。Western印跡檢測NF-κB、H-FABP蛋白表達(dá)：采血后處死取心臟，將心肌組織液氮速凍后切成細(xì)小碎片，加入RIPA裂解液，用勻漿機(jī)研磨研碎，充分裂解后，12 000 r/min離心5 min，取上清。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。經(jīng)灌膠、電泳、電轉(zhuǎn)、封閉后分別與NF-κB、H-FABP及GAPDH的一抗(抗體滴度分別為1∶1 000，1∶5 000)和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(Jackson 1∶5 000)作用，最后采用化學(xué)發(fā)光法檢測目的條帶，用凝膠成像儀拍照并測定各顯色條帶的灰度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1一般情況比較 造模后正常組飲食活動無改變，假手術(shù)組術(shù)后飲食、活動量下降，后逐漸恢復(fù)正常；模型組及中藥各組均出現(xiàn)精神萎靡、進(jìn)食減少、呼吸增快、被毛蓬松、少動、大便稀溏等癥狀，中藥各組24 h后癥狀逐漸改善，改善程度好于模型組，且隨著中藥劑量增大癥狀改善越明顯；造模后72 h，模型組共死亡5只，死亡率25.0%，中藥各組共死亡3只(其中低劑量組死亡2只，中劑量組死亡1只，高劑量組無死亡)，死亡率5.0%，假手術(shù)組、正常組無死亡，中藥各組總死亡率顯著低于模型組(P<0.05)。

2.2血清TNF-α、IL-6比較 正常組、假手術(shù)組血清TNF-α、IL-6水平無顯著差異(P>0.05)；模型組血清TNF-α、IL-6水平持續(xù)升高，48 h后下降，較正常組同時(shí)間點(diǎn)均明顯升高(P<0.01)；中藥各組血清TNF-α、IL-6水平24 h后逐漸下降，較正常組同時(shí)間點(diǎn)均明顯升高(P<0.05，P<0.0,1)；中藥各組血清TNF-α、IL-6水平同時(shí)間點(diǎn)均顯著低于模型組(P<0.01，P<0.05)，且高劑量組降低更明顯；低、中劑量組血清TNF-α、IL-6水平比較無顯著差異(P>0.05)，高劑量組上述指標(biāo)同時(shí)間點(diǎn)均較低劑量組顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α、IL-6水平比較

與正常組比較:1)P<0.05,2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01；與低劑量組比較:5)P<0.05；與24 h比較：6)P<0.05下表同

2.3各組心肌細(xì)胞NF-κB、H-FABP蛋白表達(dá)比較 正常組、假手術(shù)組心肌NF-κB、H-FABP蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05)；模型組NF-κB、H-FABP蛋白表達(dá)隨時(shí)間升高，48 h達(dá)峰值，較正常組同時(shí)間點(diǎn)明顯升高(P<0.01)；中藥各組上述指標(biāo)24 h后回調(diào)，高劑量組24 h、48 h NF-κB、H-FABP蛋白表達(dá)顯著高于正常組(P<0.05，P<0.01)，72 h無顯著差異(P>0.05)，低、中劑量組各指標(biāo)同時(shí)間點(diǎn)均顯著高于正常組(P<0.05，P<0.01)；中藥各組NF-κB、H-FABP蛋白表達(dá)較模型組同時(shí)間點(diǎn)均顯著下降(P<0.01，P<0.05)；低、中劑量組各指標(biāo)同時(shí)間點(diǎn)比較無顯著差異(P>0.05)，高劑量組48 h、72 h NF-κB、H-FABP蛋白表達(dá)顯著低于低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組心肌細(xì)胞NF-κB、H-FABP變化

3 討 論

研究表明〔10〕，膿毒癥的發(fā)病率及死亡率隨著年齡增長而升高，65歲以上人群膿毒癥罹患相對危險(xiǎn)度是青壯年的13.1倍，老年膿毒癥患者的住院死亡率及1年累計(jì)死亡率均高于非老年患者。心臟是膿毒癥常見受損器官，膿毒癥心肌損傷所致心力衰竭患者的死亡率高達(dá)70%〔11〕。肌鈣蛋白(cTn)I是心肌損傷傳統(tǒng)的特異性標(biāo)志物。膿毒癥心肌損傷4～6 h后cTnI已普遍升高，并發(fā)心力衰竭的升高更明顯，其升高程度與死亡率密切相關(guān)〔12〕。cTnI不能反映超早期心肌損傷情況。H-FABP是心肌細(xì)胞內(nèi)特有的一種小分子蛋白質(zhì)，當(dāng)心肌細(xì)胞缺血、缺氧時(shí)迅速釋放入血，血清水平在1～3 h升高，4～8 h達(dá)峰值，12～24 h恢復(fù)正?！?3〕。研究表明〔14〕，膿毒癥患者發(fā)病1 h血清H-FABP已明顯升高，與病情程度呈正相關(guān)，與心功能、生存率呈顯著負(fù)相關(guān)。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)〔15〕，膿毒癥小鼠血清H-FABP升高明顯早于cTnI出現(xiàn)，升高程度與心肌損傷病理改變一致。本研究提示老年膿毒癥大鼠心肌損傷、心功能障礙持續(xù)存在。

膿毒癥心肌損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及冠脈微血管血流改變、心肌細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮功能障礙、線粒體損傷、細(xì)胞因子失衡等〔16〕，其中TLR介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)學(xué)說被廣泛認(rèn)可，其信號通路TLR4/NF-κB/TNF-α、IL-6被認(rèn)為是膿毒癥心肌損傷的主要發(fā)病機(jī)制之一〔17〕。腸道是膿毒癥的關(guān)鍵啟動器官。膿毒癥時(shí)腸黏膜損傷，腸道菌群、內(nèi)毒素移位入血，形成腸源性內(nèi)毒性血癥，內(nèi)毒素與TLR4結(jié)合并激活單核細(xì)胞，隨后啟動髓樣分化因子(MyD88)依賴性/非依賴性通路反應(yīng)，兩者通過不同信號通路最終共同激活胞質(zhì)中的NF-κB，活化的NF-κB誘導(dǎo)TNF-α、IL-6基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而合成釋放大量炎癥因子，最終形成全身炎癥反應(yīng)綜合征，導(dǎo)致包括心肌損傷在內(nèi)的多臟器損傷〔18〕。研究表明〔19〕，炎癥反應(yīng)貫穿于膿毒癥心肌損傷疾病始終，炎癥反應(yīng)程度與預(yù)后密切相關(guān)，抑制炎癥是心肌損傷治療的重要措施。本研究提示膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，且隨著病情進(jìn)展而加重，這與心肌細(xì)胞H-FABP蛋白表達(dá)變化趨勢一致?？梢?，炎癥反應(yīng)是心肌損傷的一個(gè)重要因素。

膿毒癥屬于中醫(yī)學(xué)“熱病”“溫病”等范疇。傳統(tǒng)認(rèn)為正虛毒損，臟腑氣機(jī)失調(diào)是其基本病機(jī)，基本治則為清熱解毒，兼活血、降濁、通腑等法，延至后期，方予回陽救逆之品。事實(shí)是，膿毒癥患者多死于休克、心力衰竭等陽氣衰微時(shí)?！端貑枴ど鷼馔ㄌ煺摗吩?“陽氣者，若天與日，失其所，則折壽而不彰”。清·鄭欽安《醫(yī)理真?zhèn)鳌吩?“人之所以立命者，在活一口氣乎。氣者陽也”?？梢婈枤饽巳梭w安身立命之根本，只可溫養(yǎng)，不可妄加戳戮。《素問·陰陽應(yīng)象大論》云：“壯火食氣……少火生氣?！蹦摱景Y常伴高熱，必然戳戮陽氣，“壯火食氣”，若妄投大劑苦寒之品，易致陽氣耗散乃至厥脫，終成不治之癥。有學(xué)者認(rèn)為膿毒癥發(fā)病在于正虛，陽氣衰微是膿毒癥心肌損傷的重要病機(jī)，予溫陽益氣活血類中藥取得較好療效〔20〕。筆者認(rèn)為，膿毒癥心肌損傷為正虛邪實(shí)，毒熱傷正，心陽耗竭，陽不化氣，陰血不生，水濕痰濁瘀血等病理產(chǎn)物叢生，壅滯經(jīng)絡(luò)，變證迭起。治以溫陽育陰利水為法，方選茯苓四逆湯。茯苓四逆湯出自《傷寒論》，由茯苓、附子、干姜、人參、炙甘草組成。方中重用茯苓健脾利水，人參滋陰益氣，附子、炙甘草、干姜合為四逆湯溫陽益氣，取“少火生氣”之意。全方藥少量重，直切病機(jī)，乃溫陽育陰利水代表方。既往發(fā)現(xiàn)〔7，21〕，茯苓四逆湯能降低慢性心力衰竭患者血清TNF-α、晚期糖基化終產(chǎn)物濃度，進(jìn)而改善心功能、提高患者生活質(zhì)量。本研究提示茯苓四逆湯能明顯抑制膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子表達(dá)，隨著炎癥反應(yīng)減輕，中藥各組心肌細(xì)胞H-FABP蛋白表達(dá)逐漸降低，表明茯苓四逆湯通過抑制膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)進(jìn)而減輕心肌損傷、改善心功能，上述治療作用與茯苓四逆湯劑量高低密切相關(guān)。