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    通瘀煎對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及機制

    2020-04-30 01:45:28盧素宏姚麗梅劉瑤楊雅琴林華景
    中國老年學(xué)雜志 2020年8期
    關(guān)鍵詞:脂質(zhì)低劑量主動脈

    盧素宏 姚麗梅 劉瑤 楊雅琴 林華景

    (廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院,廣東 廣州 510520)

    動脈粥樣硬化(AS)指動脈管壁及其分支管壁內(nèi)膜和內(nèi)膜下出現(xiàn)脂質(zhì)、碳水化合物及血液成分的灶狀沉積,結(jié)締組織和鈣沉積所致,同時出現(xiàn)大量中層平滑肌細胞向內(nèi)膜移動、增殖,導(dǎo)致內(nèi)膜增厚,逐漸形成粥樣病灶或纖維脂質(zhì)斑塊病灶的一種炎癥性疾病,炎癥反應(yīng)貫穿于AS發(fā)生發(fā)展的全過程。研究表明,AS是一種炎癥反應(yīng)性疾病,炎癥反應(yīng)貫穿于AS發(fā)生和發(fā)展的全過程〔1〕,動脈管壁內(nèi)大量炎癥因子的形成和釋放與AS斑塊的形成關(guān)系密切〔2〕。在AS早期,當不穩(wěn)定斑塊出現(xiàn)破裂時,即伴隨炎癥信號通路的激活。因此,及早識別不穩(wěn)定的AS斑塊,探尋敏感而特異的血清學(xué)標志物及相關(guān)炎癥靶點,通過采用調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂、抗炎等治療,減少或阻止AS等血管事件的發(fā)生是現(xiàn)階段研究的熱點之一。目前,防治AS的藥物研究相對較少,臨床常用他汀類藥物,其對AS的防治有一定的作用,但長期服用易導(dǎo)致肝損害等不良反應(yīng)的發(fā)生〔3~5〕。中藥和中藥復(fù)方具有整體調(diào)節(jié),適應(yīng)證廣泛,毒副作用小等優(yōu)點,在AS的預(yù)防和治療上具有自身獨到的特點。通瘀煎(《景岳全書》)具有活血祛瘀,行氣止痛的功效,臨床主要用于氣滯血積,經(jīng)脈不利,痛極拒按等癥。研究表明,通瘀煎具有治療高脂血癥、改善血液流變學(xué)、抗炎等多種藥理活性〔6〕,提示其可能通過改善脂質(zhì)代謝紊亂及脂質(zhì)沉積、改善血液流變學(xué)等作用對血管壁起到較好的保護作用。本研究擬探討通瘀煎的抗AS作用及其作用機制。

    1 材料及方法

    1.1實驗動物 8周齡健康雄性SPF級載脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠50只,體重(25.0±2.0)g,購自北京微通利華實驗動物技術(shù)有限公司〔許可證號SCXK(京)2012-0001〕;8周齡SPF級雄性C57BL/6雄性小鼠10只,體重(20.0±2.0)g,購自廣東省動物實驗中心〔許可證號SCXK(粵)2015-0109〕。

    1.2通瘀煎藥材組方 當歸尾15.0 g,山楂6.0 g,香附6.0 g,紅花6.0 g,烏藥6.0 g,青皮4.5 g,澤瀉4.5 g,木香2.1 g,均購自康美藥業(yè)。阿托伐他汀鈣片(立普妥,規(guī)格:20 mg×7片)購自輝瑞制藥有限公司;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購自上海博湖生物科技有限公司。高脂飼料(3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料均勻混合而成,以鈷60輻照-輻照劑量25.0 kGy)由廣東省實驗動物中心加工。

    1.3儀器及試劑 LBY-N6B型全自動模塊式血液流變儀;生物組織包埋機(TB-718D型);智能程控生物組織自動脫水機(TC-120S型);Zeiss-Axioskop20顯微鏡電子顯微鏡、透射電鏡;E-選擇素(E-selectin)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、血管細胞黏附分子(ICAM)-1 ELISA試劑盒、血管內(nèi)皮細胞黏附分子(VCAM)-1 ELISA試劑盒、白細胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒、干擾素(IFN)-γ ELISA試劑盒均購自上海拜力生物科技有限公司???細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白(SOCS)1單抗、抗-細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化子(STAT)3單抗、抗-phospho-STAT3(Tyr701)單抗均購自廣州浩瑪生物科技有限公司。

    1.4動物分組及給藥 采用隨機數(shù)字表法,50只ApoE基因敲除小鼠隨機分為5組各10只,模型組、陽性藥物組(立普妥組)、通瘀煎低、中、高劑量組均以高脂飼料飼養(yǎng);C57BL/6雄性小鼠10只為空白組,以普通飼料喂養(yǎng)。實驗第1天起,通瘀煎高、中、低劑量組分別給予通瘀煎26.0、13.0、6.5 g/(kg·d)灌胃給藥;立普妥組給予立普妥5 mg/(kg·d)灌胃給藥(藥物均用0.5% CMC-Na配成混懸溶液后給藥),空白組、模型組給予等量0.5% CMC-Na灌胃,均持續(xù)給藥12 w。通瘀煎常規(guī)中藥煎煮,經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)濃縮成每毫升相當于1 g生藥的混懸液。

    1.5指標檢測 ①小鼠主動脈石蠟冰凍切片,以蘇木素-伊紅(HE)染色,Zeiss-Axioskop20顯微鏡下觀察主動脈管壁形態(tài)學(xué)變化情況。②AxiocanHRc相機拍攝主動脈HE染色切片,用Leica Qwin Image Processing and Analysis軟件分析切片上顯示的AS和血管橫截面管腔面積。③主動脈超薄切片,采用JEM-1200EX型透射電鏡觀察管壁超微結(jié)構(gòu)變化。④血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量的測定; ⑤ELISA檢測血液中黏附分子E-selectin、ICAM-1、VCAM-1的含量及主動脈組織內(nèi)IL-6、IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α的含量; ⑥Western印跡法分析主動脈STAT3、磷酸化(p)STAT3、SOCS1蛋白表達水平。

    1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進行正態(tài)性檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1各組主動脈組織形態(tài)學(xué) 空白組主動脈形態(tài)規(guī)則完整,內(nèi)膜光滑,沒有出現(xiàn)局部缺損或增厚,內(nèi)彈力層連續(xù)規(guī)整、無斷裂現(xiàn)象,平滑肌細胞呈整齊有序排列,未見炎性細胞浸潤,管腔內(nèi)無贅生物形成。模型組主動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯改變,內(nèi)膜明顯增生、增厚,連續(xù)性結(jié)構(gòu)破壞,大量泡沫細胞積聚在管腔內(nèi)、大量膽固醇結(jié)晶堆積,內(nèi)膜增生處明顯的缺損及間斷性鈣化灶和無結(jié)構(gòu)樣壞死物,明顯的AS斑塊纖維帽;中膜亦出現(xiàn)增厚、變形,內(nèi)膜層可見大量的平滑肌細胞堆聚。與模型組比較,各給藥組主動脈根部粥樣斑塊的形成明顯受到抑制,病變程度明顯減輕,其中通瘀煎低劑量組主動脈根部斑塊內(nèi)的脂質(zhì)中心面積相對變小,斷續(xù)性鈣化灶和無結(jié)構(gòu)樣壞死物;通瘀煎高劑量組AS病變程度最輕,僅少量鈣化灶和無結(jié)構(gòu)樣壞死物。見圖1。

    圖1 各組主動脈組織病理(HE染色,×200)

    2.2各組主動脈粥樣硬化病變相對面積 與空白組〔(0.76±0.11)%〕相比,模型組主動脈病變相對面積〔(26.37±4.59)%〕顯著增加(P<0.01)。與模型組相比,立普妥組〔(9.51±1.68)%〕、通瘀煎低、中、高劑量組主動脈病變相對面積〔(13.68±2.27)%,(12.87±2.55)%,(9.83±1.81)%〕均有明顯減少(P<0.01,P<0.05)。與通瘀煎中、低劑量組相比,立普妥組及通瘀煎高劑量組主動脈病變相對面積較少(P<0.05)。

    2.3主動脈電鏡觀察 空白組主動脈內(nèi)皮細胞排列整齊、形態(tài)正常,細胞核完整,內(nèi)彈力膜連續(xù)完整無缺損、厚薄均勻,未發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)空泡形成及膠原纖維增生。模型組主動脈出現(xiàn)一定程度的病理改變,內(nèi)皮細胞出現(xiàn)大量脫落、壞死,壞死處的內(nèi)皮細胞基本消失,出現(xiàn)大量細胞碎片及纖維樣物質(zhì),大量脂質(zhì)沉積于內(nèi)皮下方,間質(zhì)內(nèi)亦可見大量膠原纖維附著,內(nèi)彈力膜出現(xiàn)連續(xù)性破壞,部分區(qū)域有灶性溶解,大量泡沫細胞浸潤,膠原纖維顯著增多。與模型組比較,各給藥組主動脈超微結(jié)構(gòu)病理改變均有不同程度減輕,其中通瘀煎低濃度組主動脈內(nèi)皮細胞出現(xiàn)少部分脫離,有少量壞死內(nèi)皮細胞,彈力膜呈間斷性破壞,局部可見溶解,散在性脂滴浸潤于內(nèi)皮下層,有少量泡沫細胞堆積及膠原纖維增生出現(xiàn)在中膜內(nèi);通瘀煎高劑量組內(nèi)彈力膜結(jié)構(gòu)基本完整,AS超微結(jié)構(gòu)改變最少,內(nèi)皮下僅觀察到少許膠原纖維沉積及脂質(zhì)空泡浸潤。見圖2。

    圖2 各組主動脈超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡,×12 500)

    2.4各組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比較 與空白組相比,模型組TC、TG及LDL-C顯著升高、HDL-C顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,立普妥組與通瘀煎中、高劑量組TC、TG及LDL-C含量明顯降低,HDL-C含量明顯升高(P<0.05,P<0.01)。與模型組相比,通瘀煎低劑量組血脂改善并不明顯(P>0.05),但有下降的趨勢。與通瘀煎中、低劑量組相比,立普妥組和通瘀煎高劑量組TC、TG及LDL-C含量明顯降低,HDL-C含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

    表1 各組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比較

    與空白組比較:1)P<0.01;與模型組比較:2)P<0.01,3)P<0.05;與通瘀煎中、低劑量組比較:4)P<0.05;表2、3同

    2.5各組血清黏附分子含量比較 與空白組相比,模型組血清E-selectin、ICAM-1、VCAM-1含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,立普妥組、通瘀煎中、高劑量組血清E-selectin、ICAM-1、VCAM-1含量明顯降低(P<0.01,P<0.05),通瘀煎低劑量組E-selectin含量顯著降低(P<0.05),VCAM-1、ICAM-1有下降趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。通瘀煎中、低劑量組ICAM-1、VCAM-1顯著高于立普妥組和通瘀煎高劑量組(P<0.05),見表2。

    2.6各組主動脈內(nèi)炎癥因子的含量比較 與空白組相比,模型組主動脈組織IL-6、IFN-γ、TNF-α含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,立普妥組與通瘀煎高劑量組主動脈組織IL-6、IFN-γ、TNF-α含量明顯降低(P<0.01)。通瘀煎中、低劑量組主動脈組織IL-6、TNF-α含量顯著低于模型組且高于立普妥組和通瘀煎高組(P<0.05,P<0.01)。見表3。

    2.7各組主動脈STAT3、p-STAT3、SOCS1蛋白表達比較 與空白組相比,模型組主動脈組織STAT3、SOCS1含量顯著降低(P<0.01),p-STAT3顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,立普妥組、通瘀煎高、中劑量組主動脈組織STAT3、SOCS1含量明顯增高(P<0.05,P<0.01),p-STAT3含量明顯降低(P<0.01),通瘀煎低劑量組主動脈組織p-STAT3含量明顯降低(P<0.05),SOCS1含量明顯增高(P<0.05)。通瘀煎高劑量組p-STAT3含量降低及SOCS1增高顯著優(yōu)于各給藥組(P<0.05)。見表4。

    表2 各組血清E-selectin、ICAM-1、VCAM-1含量比較

    表3 各組主動脈內(nèi)炎癥因子IL-6、IFN-γ、TNF-α含量比較

    表4 各組主動脈組織STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較

    與空白組比較:1)P<0.01;與模型組比較:2)P<0.01,3)P<0.05;與通瘀煎中、低劑量組比較:4)P<0.05;與立普妥組比較:5)P<0.05

    3 討 論

    AS是臨床常見的一種血管病變,是現(xiàn)階段威脅人類健康最為嚴重的心血管疾病之一。目前,人類對AS的研究已經(jīng)由最初單一的血脂變化逐漸發(fā)展到管壁細胞學(xué)、內(nèi)皮功能紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多個方面。AS是一種炎癥性疾病,血管內(nèi)、外的炎癥反應(yīng)貫穿于AS發(fā)生發(fā)展的前過程。IL-6是炎癥反應(yīng)瀑布的源頭所在,發(fā)揮著極為重要的介導(dǎo)作用,參與AS的形成和發(fā)展過程,與AS病變程度呈正相關(guān)。IL-6通過與其受體緊密結(jié)合后,可誘導(dǎo)STAT3得以活化,活化后的STAT3(p-STAT3)可參與激活多種基因表達。研究證實,IL-6/STAT3信號傳導(dǎo)通路在AS中可被激活〔7〕,IL-6為源頭所在,其過度表達可激活STAT3信號通路,從而表現(xiàn)出促AS作用〔8〕。事實上,這種慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生,是由VCAM-1、ICAM-1和E-selectin等黏附分子所介導(dǎo)的。AS的形成過程中ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等黏附分子介導(dǎo)的炎癥過程,在AS的發(fā)生發(fā)展全程中起著非常重要的作用,可明顯增強聚集反應(yīng),導(dǎo)致斑塊的形成,并影響粥樣斑塊的穩(wěn)定性〔9,10〕。

    本研究中AS小鼠血脂、黏附分子及炎癥因子的各項指標趨勢與主動脈組織病理學(xué)變化大致相符??梢?,AS模型小鼠存在嚴重的脂質(zhì)代謝紊亂、血清黏附分子及炎癥因子大量生成,這一結(jié)果也進一步驗證實了AS是一種炎癥反應(yīng),AS的過程伴隨有大量炎癥因子的釋放。本研究提示AS模型主動脈組織中STAT3被活化,主動脈組織及血液中IL-6、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子大量表達。通過藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn),通瘀煎可糾正或改善AS小鼠脂質(zhì)代謝紊亂,減少血液中黏附分子E-selectin、VCAM-1、ICAM-1及主動脈組織中IL-6、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子的含量,誘導(dǎo)SOCS1的蛋白含量表達,減少STAT3的磷酸化,從而抑制增生信號通路IL-6/STAT3的活化,從而顯著抑制或改善AS小鼠血液黏、凝、稠、聚的“血瘀”證狀態(tài)。因此認為,通瘀煎的抗AS作用可能通過抑制IL-6/STAT3信號通路,發(fā)揮其抗炎、抗增生效應(yīng),從而有效抑制AS斑塊的形成。

    綜上,AS狀態(tài)下,主動脈組織中大量IL-6、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子的生成,可刺激STAT3增生信號通路的激活,相關(guān)的基因及蛋白表達均呈現(xiàn)出高水平表達。通瘀煎低、中、高劑量均表現(xiàn)出一定的抗AS作用,以高劑量組效果最佳。其可能通過降脂、減少炎癥因子的釋放、抑制主動脈內(nèi)炎癥及增生反應(yīng)的發(fā)生,從而表現(xiàn)出較好的抗AS斑塊形成的作用。此外,在本實驗周期范圍內(nèi),低劑量的通瘀煎具有一定的抗AS作用,但其對AS小鼠并未呈現(xiàn)出明顯的降脂作用。因此推測,低劑量通瘀煎可能不在其降脂最小有效劑量范圍,其降脂效應(yīng)在一定范圍內(nèi)可能呈劑量依賴性。但通瘀煎低劑量組主動脈根組織病理形態(tài)改變明顯優(yōu)于模型組,未發(fā)現(xiàn)有明顯粥樣斑塊的形成,提示通瘀煎可能有獨立于降脂之外的抗AS作用,這一作用可能是通過其良好的抗炎作用得以實現(xiàn)。

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