miR-138-5p通過靶向SETD6基因調(diào)控Raf/MEK/ERK通路抑制肝癌細(xì)胞遷移、侵襲的分子機(jī)制

薛華 姚豫桐 駱樂 向光明 黃孝倫

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院肝膽胰外科，四川 成都 610027)

肝癌是常見的惡性腫瘤，死亡率居于所有惡性腫瘤的第三位〔1〕。肝癌一般發(fā)現(xiàn)較晚，且進(jìn)展速度快，患者死亡率高。目前肝癌的治療主要是肝切除、肝移植、化療等綜合療法，雖然治療技術(shù)取得了一定的進(jìn)展但是肝癌患者的預(yù)后仍然較差，因此尋找新的靶向治療藥物對于肝癌的治療具有重要意義。微小RNA(miRNA) 是長度為20～24個核苷酸的小RNA，可通過與靶基因3'非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程〔2,3〕。miR-138-5p在結(jié)直腸癌(CRC)組織中下調(diào)，其表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總生存率低有關(guān)，miR-138-5p通過靶向程序性死亡配體(PD-L)1顯著抑制體內(nèi)CRC細(xì)胞生長，抑制體內(nèi)的腫瘤生成〔4〕。miR-138-5p在宮頸癌中的表達(dá)降低，促進(jìn)腫瘤的增殖〔5〕。賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(SETD6)在膀胱癌組織中高表達(dá)，過表達(dá)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖、菌落形成和遷移〔6〕。SETD6過表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、菌落形成和遷移〔7〕。但miR-138-5p在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對肝癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響，且miR-138-5p是否通過靶向SETD6調(diào)控Raf/MEK/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路影響肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移還尚未可知。本研究分析miR-138-5p是否靶向SETD6基因調(diào)控Raf/MEK/ERK通路影響肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 人正常肝細(xì)胞L02、肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3b、HuH-7細(xì)胞購于上海中科院細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于GIBCO公司，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine TM2000購于美國Invitrogen公司，Transwell小室、基質(zhì)膠購于Millipore公司，miR-con、miR-138-5p mimics序列由上海吉瑪公司合成，SETD6過表達(dá)及空載體質(zhì)粒購于北京以義翹神州生物科技有限公司，SETD6、CyclinD1、MMP-2、β-actin一抗購于美國CST公司，IgG二抗購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng) 胰蛋白酶消化L02、HepG2、Hep3b、HuH-7細(xì)胞，按照一定比例培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%CO2、37℃條件培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.2.2載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 體外合成miR-138-5p的反義互補(bǔ)序列構(gòu)建anti-miR-138-5p質(zhì)粒及其陰性質(zhì)粒anti-NC，合成miR-138-5p的前體序列構(gòu)建miR-138-5p mimic質(zhì)粒，同時構(gòu)建pcDNA、pcDNA-SETD6質(zhì)粒。lipofectamine TM2000將anti-miR-138-5p、anti-NC、si-NC、si-SETD6質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入Hep3b細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4～6 h后更換完全培養(yǎng)基。獲得穩(wěn)定高表達(dá)miR-138-5p的Hep3b細(xì)胞株，在穩(wěn)定高表達(dá)miR-138-5p的細(xì)胞株基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染si-NC、si-SETD6獲得穩(wěn)定細(xì)胞株anti-miR-138-5p+si-SETD6和anti-miR-138-5p+si-NC，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。將Hep3b細(xì)胞分為NC組(正常培養(yǎng)的細(xì)胞)、miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con)、miR-138-5p組(轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimic)、si-con組(轉(zhuǎn)染si-con)、si-SETD6組(轉(zhuǎn)染si-SETD6)、anti-miR-con組(轉(zhuǎn)染anti-miR-con)、anti-miR-138-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-138-5p)、miR-138-5p+pcDNA組(miR-138-5p和pcDNA共轉(zhuǎn)染)、miR-138-5p+pcDNA-SETD6組(miR-138-5p和pcDNA-SETD6共轉(zhuǎn)染)。

1.2.3qRT-PCR 處理后細(xì)胞提取總RNA，分別以U6、β-actin為miR-138-5p、SETD6的內(nèi)參基因。qRT-PCR體系 為20 μl：2×SYBR Mix 10 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl，H2O 8 μl，反應(yīng)程序為95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)。引物序列：miR-138-5p:正義鏈5'-AATTCAGTTGAGGAACAGGTA-3'，反義鏈5'-CTGGGCCCAGTGTTCAGACTACC-3'；U6:正義鏈 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反義鏈5'-TCACGAATTTGCGT-3'；SETD6:反義鏈5'-GGCAGTCAGCCCCTTTGTG-3'，反義鏈5'-TGCAGGGTTGTGATGAAAGGA-3'；GAPDH:正義鏈5'-ATGACTCTACCCACGGCAAG-3'，反義鏈5'-GG AAGATGGTGATGGGTTTC-3'。

1.2.4Western印跡法檢測蛋白表達(dá)情況 處理后細(xì)胞提取總蛋白，測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮10 min；蛋白按照30 μg上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶封閉1.5 h；一抗(SETD6、CyclinD1、MMP-2、β-actin)4℃孵育過夜，二抗孵育1 h；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液發(fā)光，凝膠電泳成像系統(tǒng)采集圖片，以β-actin為內(nèi)參計算蛋白表達(dá)水平。

1.2.5噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖情況 待檢測組別細(xì)胞，加入MTT 20 μl 混勻，培養(yǎng)4 h；加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl混勻，培養(yǎng)15 min；酶標(biāo)儀檢測吸光值(OD值)，計算細(xì)胞存活率。

1.2.6Transwell實(shí)驗檢測肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力 Transwells上室以每孔104個細(xì)胞添加，下室加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后棄去上室中培養(yǎng)基，棉簽擦除未穿過細(xì)胞，固定，結(jié)晶紫染色，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗；隨機(jī)選取5個低倍鏡觀察，計算遷移細(xì)胞數(shù)。

實(shí)驗前將Matrigel 膠放置于冰上解凍，按照1∶2與無血清DMEM培養(yǎng)基混勻，制備Matrigel基質(zhì)膠；將Matrigel基質(zhì)膠包被Transwells上室，每孔104個加入Transwells上室，剩余操作同遷移實(shí)驗，計算侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.2.7雙熒光素酶實(shí)驗檢測miR-138-5p 對SETD6的影響 TargetScan生物信息學(xué)預(yù)測miR-138-5p 與SETD6的互補(bǔ)序列，擴(kuò)增結(jié)合位點(diǎn)的片段，將擴(kuò)增片段插入到熒光素酶載體中，構(gòu)建野生型(WT)-SETD6-3'UTR質(zhì)粒；點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行位點(diǎn)突變，構(gòu)建突變型(MUT)SETD6-3'UTR質(zhì)粒，將WT-SETD6-3'UTR、MUT-SETD6-3'UTR、與miR-NC、miR-138-5p 分別共轉(zhuǎn)染至Hep3b細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后檢測熒光強(qiáng)度。

1.3數(shù)據(jù)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 進(jìn)行圖片的制作。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-138-5p和SETD6在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá) 與人正常肝細(xì)胞L02比較，肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3b、HuH-7中miR-138-5p的表達(dá)水平顯著降低，SETD6 mRNA及蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1。選擇Hep3b細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

表1 肝癌細(xì)胞株中miR-138-5p和SETD6的表達(dá)

與L02組比較：1)P<0.05

圖1 肝癌細(xì)胞株中SETD6蛋白表達(dá)結(jié)果

2.2轉(zhuǎn)染miR-138-5p抑制肝癌細(xì)胞遷移、侵襲 與NC、miR-con組比較，miR-138-5p組miR-138-5p的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞存活率、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目顯著減少，Western印跡檢測顯示，CyclinD1、MMP-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測轉(zhuǎn)染miR-138-5p對肝癌Hep3b細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2的表達(dá)量

表2 轉(zhuǎn)染miR-138-5p對肝癌Hep3b細(xì)胞中miR-138-5p、CyclinD1、MMP-2的表達(dá)量和遷移、侵襲的影響

與NC、miR-con組比較：1)P<0.05

2.3沉默SETD6抑制肝癌細(xì)胞遷移、侵襲 與NC、si-con組比較，si-SETD6組中SETD6蛋白水平顯著降低，細(xì)胞存活率、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目顯著減少，Western印跡檢測顯示，CyclinD1、MMP-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 沉默SETD6對肝癌Hep3b細(xì)胞中SETD6、CyclinD1、MMP-2的表達(dá)量和遷移、侵襲的影響

與NC、si-con組比較：1)P<0.05

圖3 Western 印跡檢測沉默SETD6對肝癌Hep3b細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2的表達(dá)量

2.4miR-138-5p靶向SETD6抑制SETD6蛋白的表達(dá) TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，miR-138-5p與SETD6 3'UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，推測SETD6可能是miR-138-5p是靶基因；雙熒光素酶報告實(shí)驗顯示，Hep3b細(xì)胞中miR-138-5p-WT-SETD6組SETD6表達(dá)水平顯著降低。Western印跡進(jìn)一步檢測 miR-138-5p對SETD6蛋白的影響，與miR-con組(0.96±0.04)比較，過表達(dá)miR-138-5p的Hep3b細(xì)胞中SETD6蛋白水平顯著下降(0.37±0.07，P<0.05)，與anti-miR-con組(0.87±0.11)比較，抑制miR-138-5p的Hep3b細(xì)胞中SETD6蛋白水平顯著升高(1.91±0.13，P<0.05)。見表4，圖4。

表4 miR-con或miR-138-5p與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肝癌Hep3b細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

與miR-con組比較：1)P<0.05

A：miR-138-5p和SETD6的3'UTR結(jié)合位點(diǎn)；B：Western印跡檢測肝癌Hep3b細(xì)胞中SETD6的蛋白表達(dá)結(jié)果;1～4:miR-con組、miR-138-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-138-5p組圖4 miR-138-5p靶向SETD6抑制SETD6蛋白的表達(dá)

2.5過表達(dá)SETD6逆轉(zhuǎn)miR-138-5p抑制肝癌細(xì)胞遷移、侵襲 與miR-con組比較，過表達(dá)miR-138-5p后，miR-138-5p組SETD6蛋白水平顯著降低，細(xì)胞存活率、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目顯著減少，Western印跡檢測顯示，CyclinD1、MMP-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與miR-138-5p+pcDNA組比較，過表達(dá)SETD6后，miR-138-5p+pcDNA-SETD6組SETD6蛋白水平顯著升高，細(xì)胞存活率、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目顯著升高，Western印跡檢測顯示，CyclinD1、MMP-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表5，圖5。

2.6miR-138-5p靶向SETD6基因?qū)af/MEK/ERK信號通路的影響 與miR-con組比較，過表達(dá)miR-138-5p后，miR-138-5p組Raf、p-MEK、p-ERK蛋白水平顯著降低，與miR-138-5p+pcDNA組比較，過表達(dá)SETD6后，miR-138-5p+pcDNA-SETD6組Raf、p-MEK、p-ERK蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表6，圖6。

表5 過表達(dá)SETD6和轉(zhuǎn)染miR-138-5p對肝癌Hep3b細(xì)胞中SETD6、CyclinD1和MMP-2的表達(dá)量及細(xì)胞侵襲遷移的影響

與miR-con組比較：1)P<0.05；與miR-138-5p+pcDNA組比較:2)P<0.05；表6同

1～4:miR-con組、miR-138-5p組、miR-138-5p+pcDNA組、miR-138-5p+pcDNA-SETD6組，圖6同圖5 Western 印跡檢測肝癌Hep3b細(xì)胞中SETD6、CyclinD1和MMP-2的表達(dá)

表6 miR-138-5p靶向SETD6基因?qū)af/MEK/ERK信號通路中Raf、p-MEK、p-ERK的蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響

圖6 Western印跡檢測miR-138-5p靶向SETD6基因?qū)af/MEK/ERK信號通路中Raf、p-MEK、p-ERK的蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

肝癌是常見的癌癥類型，與其他類型癌癥相比，肝癌進(jìn)展快速，是引起癌癥死亡的主要原因〔8〕。目前對于肝癌的治療主要包括手術(shù)、化療、放療、激素治療和靶向治療，但是耐藥性和腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍然影響患者的預(yù)后生存時間。所以尋找新的靶向治療分子，探究其作用機(jī)制對肝癌的治療具有重要意義。

miRNA 是內(nèi)源性非編碼小RNA，通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因3'UTR結(jié)合，調(diào)控靶基因mRNA水平的表達(dá)。miRNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程〔9〕。乳腺癌細(xì)胞中，mir-138-5p水平顯著降低，mir-138-5p以LIMK1為靶點(diǎn)抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移〔10〕。mir-138-5p抑制宮頸癌、胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移〔11〕。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。研究報道，過表達(dá)mir-138-5p可抑制子宮癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展〔11〕。mir-138-5p通過靶向ZEB2抑制肺腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、增殖和轉(zhuǎn)移〔12〕。miR-138-5p通過靶向BIRC5抑制了膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲特性〔13〕。mir-138-5p在癌細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)抑制癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲〔14〕。本研究提示過表達(dá)miR-138-5p 可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤組織的生長。

本研究還發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞株中SETD6水平顯著高于正常肝細(xì)胞，其可能參與肝癌的疾病進(jìn)展過程。SETD6屬于組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶中有SET結(jié)構(gòu)域的蛋白，該家族具有高度統(tǒng)一保守性的SE結(jié)構(gòu)域。研究顯示，SETD家族蛋白在多種細(xì)胞中表達(dá)，且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔15〕。SETD6在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，SETD6表達(dá)缺失，引起細(xì)胞的生殖缺陷。SETD6催化WDR5的賴氨酸207和325甲基化促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移〔16〕。在多個肝癌細(xì)胞系中沉默SETD6，可抑制細(xì)胞增殖，同時細(xì)胞周期抑制劑CDKN1A的表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔17,3〕。本研究結(jié)果提示抑制SETD6蛋白的表達(dá)可抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，與上述研究結(jié)果一致。

TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示miR-138-5p 與SETD6有特異性互補(bǔ)序列，雙熒光素酶基因報告、Western印跡進(jìn)一步驗證顯示miR-138-5p 可通過與SETD6 3'UTR區(qū)域直接結(jié)合負(fù)性調(diào)控SETD6的表達(dá)。進(jìn)一步驗證miR-138-5p 靶向SETD6對肝癌細(xì)胞的影響，在穩(wěn)定高表達(dá)miR-138-5p 的基礎(chǔ)上過表達(dá)SETD6基因，結(jié)果顯示，細(xì)胞存活率、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)顯著升高，提示過表達(dá)SETD6基因可逆轉(zhuǎn)高表達(dá)miR-138-5p 對肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)SETD6是miR-138-5p 的靶基因。

Raf/MEK/ERK信號是可被廣泛激活的有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，該通路可傳遞細(xì)胞信號，引起細(xì)胞內(nèi)特異蛋白的表達(dá)變化〔18〕。研究報道，Raf/MEK/ERK通路促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞生長、增殖〔19〕。本研究提示過表達(dá)miR-138-5p抑制Raf/MEK/ERK通路的激活，抑制細(xì)胞增殖，可通過調(diào)節(jié)SETD6表達(dá)激活Raf/MEK/ERK通路。從機(jī)制上講，miR-138-5p調(diào)控SETD6的表達(dá)調(diào)控Raf/MEK/ERK通路，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。