sPD-L1在肺癌患者血清及胸膜腔積液中水平差異及相關(guān)性分析

趙 爽,熊 芳

(重慶三峽中心醫(yī)院 1.健康管理中心；2.重癥醫(yī)學(xué)科，重慶404000)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是常見(jiàn)的惡性肺部腫瘤病變,其主要病理類(lèi)型類(lèi)為腺癌和鱗癌,由于缺乏有效的早期檢查手段,確診時(shí)78%-80%患者已屬晚期,臨床晚期NSCLC患者約80%伴有惡性胸膜腔積液[1]。目前,針對(duì)程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death legend1,PD-L1)/程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed cell death-1,PD-1)的治療已成為肺癌治療的重要研究方向[2,3]。PD-1/PD-L1通路是機(jī)體免疫檢查點(diǎn)之一,其生理作用是維持機(jī)體的免疫耐受和避免過(guò)度的免疫反應(yīng)對(duì)正常組織造成損害。然而腫瘤細(xì)胞可利用PD-1/ PD-L1通路產(chǎn)生抑制性的腫瘤微環(huán)境獲得免疫逃逸[4]。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的PD-L1包括膜表達(dá)型(mPD-L1)和可溶型(sPD-L1)。mPD-L1常在細(xì)胞和組織中被檢測(cè)到,而sPD-L1則可通過(guò)病人的外周血液和體腔積液被檢測(cè)。已有研究顯示肺癌病人外周血液中的sPD-L1和胸腔積液中的sPD-L1水平均升高,且對(duì)患者預(yù)后和對(duì)免疫治療的反應(yīng)性具有指示作用[5,6]。但不同病理類(lèi)型的肺癌發(fā)病的機(jī)制和腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為不同,提示患者體內(nèi)sPD-L1分布可能不同,為了進(jìn)一步確證不同病理類(lèi)型肺癌患者體內(nèi)的sPD-L1表達(dá)特征,以便后續(xù)研究更準(zhǔn)確的探索其臨床價(jià)值,我們?cè)诜治隽?4例伴隨胸腔積液的肺癌患者的臨床資料的基礎(chǔ)上,分別檢測(cè)患者外周血液和胸腔積液中sPD-L1水平,并進(jìn)行相關(guān)性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對(duì)象 收集2016年12月至2018年5月在我院重癥醫(yī)學(xué)科收治的64例肺癌病人的血液標(biāo)本和胸膜腔積液標(biāo)本,所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷為NSCLC(肺腺癌或鱗癌),所有患者均有詳細(xì)的病歷資料,包括：性別、年齡、吸煙情況、腫瘤大小、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、病理類(lèi)型等。入選患者中男性47例,女性17例,年齡35-83歲,肺腺癌38例、肺鱗癌26例,根據(jù)第八版肺癌TNM分期Ⅰ期3例, Ⅱ期7例,Ⅲ期20例,Ⅳ期34例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)同意并得到批準(zhǔn),所有入組患者均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2研究主要試劑和設(shè)備 人細(xì)胞程序性死亡蛋白1配體1(PDCD1LG1)ELISA檢測(cè)試劑盒：USCN000518,美國(guó)；酶標(biāo)儀：Bio-Rad美國(guó)。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 采集病人外周血3 ml并置于抗凝管中,1 000×g 離心10 min后取上層液體分裝后置于-80℃冰箱中冷凍保存。行胸腔穿刺術(shù)抽取病人胸腔積液30 ml,在低溫離心機(jī)中以1 000×g離心10 min后收集上清并分裝保存于-80 ℃冰箱內(nèi),用于測(cè)定sPD-L1水平。

1.2.2sPD-L1的檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)外周血和胸腔積液sPD-L1水平,操作步驟根據(jù)“人細(xì)胞程序性死亡蛋白1配體1(PDCD1LG1)ELISA檢測(cè)試劑盒”說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,簡(jiǎn)要步驟如下：首先吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體；清洗液洗滌3次后分別加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品100 μl,1孔只加稀釋液作為對(duì)照；37℃反應(yīng)90 min后用棄去酶標(biāo)板內(nèi)的液體；清洗液洗滌2次后加入生物素化人ANG抗體工作液各100 μl,37℃反應(yīng)60 min；清洗液清洗3次后各加入100 μl ABC工作液,37℃反應(yīng)30 min；清洗液洗滌5次,加入顯色液輕微震蕩混勻,避光孵育20 min,每孔加入100 μl終止液終止反應(yīng),并在30 min之內(nèi)使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度值,根據(jù)吸光度值計(jì)算外周血和胸腔積液sPD-L1的水平。

2 結(jié)果

2.1 外周血及胸腔積液sPD-L1水平與臨床病理因素的關(guān)系

病人年齡多數(shù)大于60歲( 68.8%),且多為男性(73.4%),約77%的患者有吸煙史；腫瘤病灶最長(zhǎng)徑之和大于7 cm者38例,占59.4%；根據(jù)第七版肺癌TNM分期,Ⅰ/Ⅱ期共10例,Ⅲ/Ⅳ期共54例；48例患者確診時(shí)已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步分析sPD-L1水平與臨床病理因素間關(guān)系發(fā)現(xiàn),患者年齡、性別、吸煙狀況與sPD-L1水平均無(wú)關(guān)系(P>0.05),而在腫瘤大小、TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),腫瘤>7 cm者胸膜腔積液內(nèi)sPD-L1水平較腫瘤≤7 cm者高,Ⅲ/Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者胸腔積液和外周血中sPD-L1水平均較高。 見(jiàn)表1。

2.2 肺腺癌、肺鱗癌患者外周血和胸腔積液中sPD-L1水平的比較

肺腺癌中外周血sPD-L1水平為(1.71±0.13)ng/mL,胸腔積液中sPD-L1水平為 (1.26±0.11)ng/mL；肺鱗癌中外周血sPD-L1水平為(1.86±0.30)ng/mL,胸腔積液中sPD-L1水平為(0.89±0.14)ng/mL。無(wú)論肺腺癌或肺鱗癌,外周血中sPD-L1均高于胸腔積液中sPD-L1水平(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 患者外周血和胸腔積液中sPD-L1水平的相關(guān)性分析

分析患者外周血和胸膜腔積液中sPD-L1水平的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者外周血和胸腔積液中sPD-L1水平存在相關(guān)性(P<0.01,r=0.63),而肺鱗癌患者外周血sPD-L1水平和胸腔積液中sPD-L1水平不相關(guān)(P>0.05,r=0.12)。見(jiàn)圖1。

表1 肺癌患者外周血和胸腔積液sPD-L1水平與臨床病理因素的關(guān)系

表2 64例肺癌患者外周血和胸腔積液中sPD-L1水平

圖1 肺腺癌和肺鱗癌患者外周血sPD-L1水平和胸腔積液中sPD-L1水平的相關(guān)性

3 討論

阻斷PD-1/PD-L1通路使肺癌的治療邁入了一個(gè)新的臺(tái)階。多項(xiàng)試驗(yàn)表明,免疫檢查點(diǎn)抑制劑在PD-L1高表達(dá)的肺癌患者中療效更顯著[7]。但目前對(duì)患者體內(nèi)PD-L1表達(dá)水平仍缺乏準(zhǔn)確統(tǒng)一的檢測(cè)和分析方法,臨床上使用的仍為傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)法,但現(xiàn)有研究表明同一患者在不同的抗體、不同的檢測(cè)平臺(tái)、不同的判讀標(biāo)準(zhǔn)下所檢測(cè)出的PD-L1表達(dá)水平存在差異[8],故而探尋更為科學(xué)有效的PD-L1表達(dá)情況檢測(cè)方法是目前臨床肺癌治療及檢驗(yàn)學(xué)科亟需解決的命題。機(jī)體免疫系統(tǒng)中PD-L1分別以細(xì)胞膜型和可溶性分子兩種形式存在,且sPD-L1的含量與mPD-L1的表達(dá)強(qiáng)度相關(guān),二者具有相似的生物學(xué)功能,均能在抗腫瘤免疫中起負(fù)調(diào)控作用[9]。提示sPD-L1可能作為肺癌診斷、治療監(jiān)測(cè)及判斷預(yù)后的一個(gè)良好指標(biāo),且sPD-L1可在體液中被檢測(cè),取材方便,因此,深入研究sPD-L1在腫瘤患者體內(nèi)的表達(dá)情況有望成為提高PD-L1檢測(cè)水平、方便PD-1/PD-L1高表達(dá)患者的治療監(jiān)測(cè)及判斷預(yù)后的有效方法,最終服務(wù)于腫瘤患者接受更精準(zhǔn)的治療。

本研究在不同病理類(lèi)型肺癌中分析患者血清及胸膜腔積液中sPD-L1的表達(dá)水平及差異,結(jié)果顯示雖然肺腺癌及肺鱗癌外周血中sPD-L1均高于胸腔積液中sPD-L1水平,但肺鱗癌患者外周血內(nèi)sPD-L1水平高于肺腺癌患者,而胸膜腔積液內(nèi)sPD-L1水平卻是肺腺癌患者高于肺鱗癌,說(shuō)明不同病理類(lèi)型的NSCLC患者體液內(nèi)sPD-L1的分布存在差異。提示不同病理類(lèi)型的腫瘤檢測(cè)sPD-L1的標(biāo)本來(lái)源或參考基線(xiàn)值應(yīng)該不同。分別對(duì)肺腺癌和肺鱗癌患者外周血和胸腔積液中sPD-L1水平行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示僅肺腺癌患者外周血和胸腔積液中sPD-L1含量存在相關(guān)性,提示肺腺癌患者的胸膜腔積液中sPD-L1水平對(duì)患者腫瘤組織中PD-1/PD-L1表達(dá)具有更重要的提示作用。目前,已經(jīng)有研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的血液循環(huán)內(nèi)的sPD-L1來(lái)自腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體[10],故而不同病理類(lèi)型患者體內(nèi)sPD-L1水平分布不同可能與腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)功能相關(guān),其中更深層次的原因還有待進(jìn)一步研究。

總而言之,目前因缺乏統(tǒng)一有效的檢測(cè)和分析方法,加大了國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究sPD-L1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用的難度。但其作為一個(gè)重要的PD-1/PD-L1通路相關(guān)分子,有必要對(duì)其進(jìn)行深入研究。作為阻斷PD-1/PD-L1通路治療的重要受益者,肺癌患者尤其是不同病理類(lèi)型的肺癌患者體內(nèi)sPD-L1表達(dá)特征及水平差異,或提示不同病理類(lèi)型的腫瘤患者其PD-1/PD-L1表達(dá)水平的檢測(cè)方法或可不同。