PCR技術(shù)在病原菌診斷中的研究進(jìn)展

干 馳，莫 茜，陶 悅

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心·兒科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，上海200127)

傳統(tǒng)病原菌檢測方法如培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定等都存在耗時(shí)長、特異性差、靈敏度低等缺點(diǎn)。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的出現(xiàn)，大大促進(jìn)了病原菌檢測技術(shù)的進(jìn)步。該技術(shù)通過對病原菌特定基因片段進(jìn)行指數(shù)級放大，進(jìn)一步對擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析，可完成病原菌分類、鑒定，甚至提供抗生素耐藥信息，不僅具有較好的特異性和靈敏性，還可將整個(gè)病原菌鑒定耗時(shí)縮減至一到兩天甚至一個(gè)小時(shí)，對臨床感染性疾病的高效快速診斷，合理使用抗生素具有指導(dǎo)意義。本文就PCR技術(shù)在病原菌診斷的應(yīng)用原理、研究進(jìn)展等做一綜述。

1 普通PCR檢測病原菌

1985年，Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)[1]，通過體外模擬DNA合成過程，可以對目的基因片段進(jìn)行指數(shù)級擴(kuò)增?；诓≡鶧NA或RNA檢測的PCR技術(shù)，因其靈敏度高、特異性好、成本低、耗時(shí)較少等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為臨床實(shí)驗(yàn)室病原菌檢測的重要手段之一。

1.1 通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因檢測細(xì)菌感染

16S rRNA是原核生物的一種核糖體RNA，是所有原核生物蛋白質(zhì)合成所必需的。16S rRNA基因由保守區(qū)和高變區(qū)交錯(cuò)排列組成，保守區(qū)為所有細(xì)菌所共有，高變區(qū)在不同細(xì)菌間存在不同程度的差異，具有屬或種的特異性。因此，可根據(jù)16S rRNA基因保守區(qū)設(shè)計(jì)細(xì)菌PCR檢測的通用引物，也可根據(jù)可變區(qū)設(shè)計(jì)細(xì)菌的特異引物或探針。一方面其分子量大小適中，長度約1 500 bp[2]，適合作為PCR檢測的目的基因，結(jié)合測序可以進(jìn)一步明確細(xì)菌種屬。另一方面，每個(gè)細(xì)菌含有5-10個(gè)16S rRNA基因拷貝，拷貝數(shù)較高，使得檢測具有較高的敏感性。

Marin等通過16S rRNA基因PCR檢測和傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)兩種方法對321例假體關(guān)節(jié)樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，兩種方法靈敏度相當(dāng)，但PCR檢測特異性更高(100%/82%)，PCR檢測陽性可以提示假體關(guān)節(jié)感染[3]。Guembe等通過普通PCR擴(kuò)增16S rRNA基因檢測219例靜脈輸液港表面薄膜樣本，預(yù)測靜脈輸液港相關(guān)的血流感染，其靈敏度達(dá)到73.3%，特異性為87.3%，提示PCR檢測靜脈輸液港相關(guān)的血流感染可作為傳統(tǒng)培養(yǎng)法的一個(gè)有效補(bǔ)充[4]。但是，16S rRNA基因也因其高度保守，常常只能鑒定至屬的水平，對于更明確的細(xì)菌分類則需要更精確的鑒定方法[5]。

1.2 通用引物擴(kuò)增真菌26S rRNA 基因、ITS(Internal Transcribed Spacer)序列檢測真菌感染

近年來，臨床真菌感染問題越來越多，真菌檢測對臨床的診斷與治療變得尤為重要，PCR技術(shù)也越來越多的應(yīng)用于真菌的檢測和鑒定中。真菌在進(jìn)化過程中形成的一些特殊DNA序列常作為PCR的檢測靶標(biāo)，例如真菌26S rRNA 基因D1/D2 區(qū)位于真菌核糖體大亞基基因的5′端，長度約600 bp，具有較高的變異率，因此通過PCR擴(kuò)增該區(qū)域并進(jìn)行序列分析，可鑒定真菌感染。此外，真菌ITS區(qū)域?yàn)檗D(zhuǎn)錄間區(qū)，不同真菌的ITS區(qū)間的長度和序列則差異較大，因此ITS序列常被用于區(qū)分親緣關(guān)系較近的真菌。

Hesham等通過PCR檢測念珠菌分離株26S rRNA基因 D1/D2序列，序列分析顯示與Genebank數(shù)據(jù)庫中6種念珠菌高度同源，匹配度達(dá)到99%-100%，結(jié)合變性凝膠電泳技術(shù)可根據(jù)電泳條帶大小直觀鑒別出六種念珠菌[6]。Rampini等比較了251例非免疫功能缺陷患者臨床標(biāo)本的ITS PCR結(jié)果與真菌培養(yǎng)結(jié)果，其一致性達(dá)到了89.6%。以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，ITS PCR分析的靈敏度和特異度分別達(dá)到87.7%和90.3%，陽性和陰性預(yù)測值分別為76%和95.5%，且與培養(yǎng)相比，ITS PCR檢測耗時(shí)僅為兩個(gè)工作日，對于罕見真菌的鑒定、及時(shí)抗真菌治療等應(yīng)用具有明顯優(yōu)勢[7]。

1.3 特異性引物擴(kuò)增特異基因鑒定病原菌種類

通用引物PCR檢測病原菌需結(jié)合測序才能明確細(xì)菌或真菌種類，而特異性引物PCR可通過檢測病原菌特異表達(dá)基因，避免對其他種屬微生物或宿主基因產(chǎn)生交叉反應(yīng)，因此可直接鑒別病原菌，無需結(jié)合測序。最常見的特異性檢測是mecA 基因的擴(kuò)增，以篩選甲氧西林耐藥。王錦萍等利用PCR擴(kuò)增檢測30株肺結(jié)核并發(fā)感染凝固酶陰性葡萄球菌，其mecA基因檢出率達(dá)到100.0%，耐藥表型與耐藥基因型的檢出率高度一致[9]。Brakstad等利用普通PCR檢測金葡菌熱穩(wěn)定核酸酶基因nuc(270 bp DNA片段)，可檢出最低10個(gè)菌落形成單位(Colony-Forming Units，CFU)金葡菌或0.69 pg基因組DNA，在臨床金葡菌感染快速診斷中具有較好的前景[8]。但是利用特異性引物PCR檢測病原菌其一次反應(yīng)僅可檢測一個(gè)目的基因，而臨床病原菌種類繁多，對于臨床病原菌快速診斷價(jià)值有限[10]，僅在PCR技術(shù)發(fā)明早期少量應(yīng)用于病原菌檢測，現(xiàn)如今主要應(yīng)用于科研單位研究或作為開發(fā)多重PCR技術(shù)的基礎(chǔ)。

2 多重PCR檢測病原菌

多重PCR技術(shù)原理與普通PCR無異，區(qū)別在于反應(yīng)體系中至少有兩對特異性引物[11]，同時(shí)檢測多個(gè)基因，大大提高了病原菌鑒定的效率[10]。多重PCR僅需一次反應(yīng)即可完成多個(gè)病原菌或耐藥基因的檢測，其對于社區(qū)醫(yī)院或測序服務(wù)不完善地區(qū)的臨床病原菌分子診斷方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。目前已有多種多重PCR系統(tǒng)逐步應(yīng)用于臨床，成為當(dāng)下病原菌快速診斷的主流工具。具體見表1。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測病原菌

普通PCR只能定性或半定量檢測臨床樣本中的病原菌DNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR則利用熒光染料或探針，在擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號，并通過制定標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確定量樣本目的基因的初始拷貝數(shù)，已經(jīng)成為臨床部分病原菌檢測的常規(guī)手段。2018年，Bispo等開發(fā)驗(yàn)證了一項(xiàng)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，可用于快速檢測葡萄膜炎樣本中的常見病毒：單純皰疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)和剛地弓形蟲。研究人員對比驗(yàn)證了30例感染性葡萄膜炎樣本和78例對照樣本，發(fā)現(xiàn)該檢測方法靈敏度較高，單純皰疹病毒和弓形蟲的檢測下限分別可達(dá)20和 200個(gè)拷貝，且所有的擴(kuò)增均得到了測序驗(yàn)證。提示該方法可以快速、靈敏、可靠地檢測和識別傳染性葡萄膜炎常見病原體[19]。對于遺傳物質(zhì)是RNA的病原菌如HIV病毒、登革熱病毒和寨卡病毒等，則需將RNA逆轉(zhuǎn)錄形成DNA后再進(jìn)行檢測[20]。美國Cepheid公司基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理，開發(fā)了GeneXpert系列平臺，可快速檢測結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥情況[21]、耐甲氧西林金黃葡萄球菌、艱難梭菌毒素等，從原始標(biāo)本采集到結(jié)果獲得僅需1-2小時(shí)，靈敏度超過了93%，顯示出良好的應(yīng)用前景[22]。

表1 基于多重PCR原理的病原菌或耐藥基因檢測新工具

注：“/”未見相關(guān)報(bào)道

4 數(shù)字PCR(digital PCR)檢測病原菌

數(shù)字PCR又稱單分子PCR，是PCR技術(shù)的最新研究進(jìn)展，具有高靈敏度和精確性等優(yōu)勢，其原理是將單個(gè)DNA分子置于獨(dú)立的反應(yīng)器中(微滴或芯片等)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過讀取熒光信號，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算樣本目的DNA初始拷貝數(shù)[23,24]。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR不需要制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，省時(shí)省力。有研究將數(shù)字PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相結(jié)合(RT-ddPCR法)對戊型肝炎病毒RNA進(jìn)行檢測和定量，顯示出較高的靈敏度[25]。Srisutham等利用數(shù)字PCR檢測血流瘧原蟲感染并對其進(jìn)行絕對定量，結(jié)果顯示該數(shù)字PCR系統(tǒng)對血流中瘧原蟲屬的檢測下限可達(dá)到11個(gè)/ml[26]。數(shù)字PCR也是當(dāng)下唯一可以實(shí)現(xiàn)病原菌目的基因拷貝數(shù)絕對定量的PCR方法，但其成本較高，尚沒有得到普及[27]。未來如能降低成本，并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)操作智能化，數(shù)字PCR將在臨床病原菌檢測中發(fā)揮更加重要的作用。

5 展望

PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，作為分子診斷的基礎(chǔ)，已經(jīng)證明了其在病原菌診斷中的價(jià)值。伴隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法的快速發(fā)展， PCR技術(shù)已經(jīng)一定程度降低了以往病原菌檢測對傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的依賴，并成為傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的有效補(bǔ)充。但是，正因?yàn)镻CR法較高的敏感度，也對臨床樣本采集和實(shí)驗(yàn)環(huán)境提出了更高要求。此外，相關(guān)試劑儀器設(shè)備高昂的價(jià)格和嚴(yán)苛的實(shí)驗(yàn)環(huán)境依然是其在社區(qū)醫(yī)院或偏遠(yuǎn)地區(qū)應(yīng)用的障礙。任何一項(xiàng)病原菌檢測技術(shù)都有其優(yōu)缺點(diǎn)，所以PCR技術(shù)仍值得更深入的研究和更廣泛的推廣使用。