姜黃素抵抗膿毒癥心肌損傷新機(jī)制探究

曹星，吳巖，馮建宇，金振曉，馬繼鵬，翟蒙恩，曹磊

膿毒癥是微生物感染引起的系統(tǒng)性宿主反應(yīng)，其特征在于全身炎癥狀態(tài)（稱為全身炎癥反應(yīng)綜合征）和多種器官功能障礙［1］。心臟是易受膿毒癥損傷的靶器官之一，充分證據(jù)顯示膿毒癥可以導(dǎo)致心臟功能障礙［2］。據(jù)報(bào)道，膿毒癥患者并發(fā)心臟功能障礙死亡率高達(dá)70%～90%，而無心臟功能障礙的膿毒癥患者死亡率為約20%［3］。因此，尋找有效策略保護(hù)膿毒癥患者心臟功能或緩解膿毒癥引起的心臟功能障礙是目前臨床上急需解決的重大問題。

姜黃素（Curcumin，Cur）是姜黃根莖的主要提取物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠有效改善心肌缺血再灌注損傷［4］、心肌梗死［5］、化療藥物多柔比星誘發(fā)的心肌細(xì)胞損傷［6］等心血管疾病，其心肌保護(hù)作用越來越受到重視。此外，姜黃素也可有效改善膿毒癥引起的心肌損傷［3］，但其具體分子機(jī)制尚未完全闡明。SIRT3是線粒體內(nèi)最主要的去乙?；浮３浞肿C據(jù)顯示，激活SIRT3信號(hào)通路是改善膿毒癥引起的多種器官功能障礙的重要策略［7-8］。最新證據(jù)顯示，姜黃素可以通過激活SIRT3信號(hào)通路緩解心肌缺血再灌注損傷［9］以及慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌線粒體損傷［10］。然而，SIRT3是否介導(dǎo)姜黃素抗膿毒癥心肌損傷作用尚不清楚。本研究旨在觀察姜黃素對(duì)膿毒癥小鼠心臟功能、氧化應(yīng)激和凋亡的影響，并闡明SIRT3信號(hào)通路是否介導(dǎo)姜黃素心肌保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑姜黃素、DAPI（苯基吲哚）染液購(gòu)自Sigma 公司；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP 缺口末端標(biāo)記（TUNEL）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche公司；BCA蛋白濃度定量試劑盒購(gòu)自Pierce公司；SIRT3特異性抑制劑3-TYP 由空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心外科實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予；活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 膿毒癥模型構(gòu)建按照先前文獻(xiàn)描述的方法構(gòu)建小鼠盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation perforation，CLP）模型［11］。簡(jiǎn)言之，用異氟烷（2%）將小鼠全身麻醉，腹部消毒后行腹部正中切口（約1.5 cm長(zhǎng)）。將盲腸分離并小心地從腹部左側(cè)取出后，結(jié)扎盲腸中段。然后，用18 G 針頭將盲腸穿刺兩次，并將盲腸移回腹膜腔。將盲腸重新定位到腹腔后，關(guān)閉腹部切口。對(duì)于假手術(shù)組小鼠，進(jìn)行相同的外科手術(shù)，但沒有進(jìn)行結(jié)扎和穿刺。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6

組：假手術(shù)（Sham）組；單純姜黃素預(yù)處理（Cur）組；CLP 組；姜黃素預(yù)處理+CLP（Cur+CLP）組；3-TYP預(yù)處理+姜黃素預(yù)處理+CLP（3-TYP+Cur+CLP）組；3-TYP 預(yù)處理+CLP（3-TYP+CLP）組。SIRT3抑制劑3-TYP（50 mg／kg）于術(shù)前3日每天通過腹腔注射給藥，共給藥3次。姜黃素（80 mg／kg）于術(shù)前3日，每日通過腹腔注射給藥，共給藥3次。

1.4 心臟功能測(cè)定所有超聲心動(dòng)檢查均由超聲科醫(yī)師進(jìn)行且對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)分組不知情。CLP 術(shù)后2 d，使用配備有RMV-707（30 MHz）探頭的Vevo 770高分辨率體內(nèi)成像系統(tǒng)（VisualSonics公司）進(jìn)行超聲檢測(cè)，隨后分析計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular ejection fraction shortening，LVFS）。具體操作方法如以往文獻(xiàn)所述［12］。

1.5 心肌凋亡率檢測(cè)將石蠟包埋的心臟切片用二甲苯脫蠟，然后用不同濃度的乙醇脫蠟。通過TUNEL 染色測(cè)定用于原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)，具體操作流程參考以往文獻(xiàn)方法［13］。用DAPI溶液染色細(xì)胞核并用共聚焦顯微鏡拍照。從每個(gè)心臟切片視野內(nèi)隨機(jī)取10 個(gè)隨機(jī)圖像，并使用Image Pro-Plus軟件（NIH）計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率。凋亡率＝TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞核／所有細(xì)胞核×100%。

1.6 心臟ROS產(chǎn)量和MDA含量測(cè)定將液氮冰凍的新鮮心臟組織通過冰凍切片機(jī)切成10μm厚的冰凍切片，將心臟切片在37℃下與二氫乙錠（DHE，2μmol，Invitrogen公司）一起溫育1 h，評(píng)估ROS產(chǎn)量，具體實(shí)驗(yàn)操作步驟參考以往文獻(xiàn)［13］。用激光共聚焦掃描顯微鏡（Olympus公司）進(jìn)行掃描心肌組織超氧化物陰離子熒光探針（dihydroethidium，DHE）染色并拍照，用Image Pro-Plus軟件計(jì)算心肌ROS產(chǎn)量。DHE的激發(fā)／發(fā)射光譜分別為488和610 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為585 nm。將冰凍心臟組織和生理鹽水按照1∶9的比例勻漿后吸取上清液，嚴(yán)格按照MDA試劑盒說明書檢測(cè)心肌組織內(nèi)MDA含量。

1.7 凋亡相關(guān)蛋白和SIRT3通路蛋白表達(dá)測(cè)定用含1 mmol 苯甲基磺酰氟（PMSF）（ST505，Beyondtime公司）的RIPA緩沖液（P0013C，Beyondtime公司）裂解心臟組織。將30μg 總蛋白質(zhì)在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠上進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。用TBS-Tween 稀釋的5%奶粉封閉1 h 后，用一抗在4℃下探測(cè)蛋白質(zhì)過夜。用TBS-Tween洗滌3次后，將膜與相應(yīng)的與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育1 h，然后用化學(xué)發(fā)光（ECL）法以檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶并使用Image Lab軟件定量分析。實(shí)驗(yàn)所用一抗為：抗SIRT3（1∶1 000，Abcam 公司）、Ac-SOD2（1∶500，Abcam公司）、Bcl-2（1∶1 000，CST 公司）、Bax（1∶1 000，CST 公司）、Caspase-3（1∶1 000，CST 公司）和β-actin（1∶1 000，碧云天公司）抗體。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素預(yù)處理激活膿毒癥小鼠心肌SIRT3信號(hào)通路首先，檢測(cè)了各組小鼠心肌組織內(nèi)SIRT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與Sham組小鼠相比，膿毒癥小鼠心肌組織內(nèi)SIRT3的表達(dá)量明顯降低，而SIRT3下游分子SOD2 的乙?；剑ˋc-SOD2）明顯增高（P＜0.05）。與CLP 組相比，Cur+CLP組小鼠心肌組織SIRT3的表達(dá)量明顯增高，而Ac-SOD2的表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。與Sham組相比，Cur 組小鼠SIRT3的表達(dá)量無明顯區(qū)別（P＞0.05）。為了進(jìn)一步明確SIRT3信號(hào)通路是否介導(dǎo)姜黃素預(yù)處理的心肌保護(hù)作用，筆者通過SIRT3特異性活性抑制劑3-TYP 阻斷SIRT3信號(hào)通路。如以往文獻(xiàn)報(bào)道［13］，3-TYP 處理對(duì)于SIRT3的表達(dá)情況無明顯影響（P＞0.05），但SIRT3的活性明顯減弱，表現(xiàn)為SIRT3靶蛋白SOD2 的乙?；矫黠@增高（P＜0.05，見圖1）。

2.2 姜黃素預(yù)處理改善膿毒癥小鼠心臟功能，降低血清內(nèi)LDH含量與Sham組小鼠相比，單純給予姜黃素預(yù)處理對(duì)于LVEF、LVFS以及血清內(nèi)LDH含量均無明顯影響（P＞0.05）。與Sham組小鼠相比，CLP 術(shù)后2 d小鼠LVEF 和LVFS均明顯降低，而血清LDH水平明顯增高（P＜0.05）。而與CLP 組小鼠相比，Cur+CLP 組小鼠LVEF 和LVFS均明顯增高，而血清LDH水平明顯降低（P＜0.05）。與Cur+CLP 組小鼠相比，3-TYP+Cur+CLP 組小鼠LVEF和LVFS均明顯降低，而血清LDH水平明顯增高（P＜0.05）。3-TYP +CLP 組 與CLP 組 小 鼠 相 比，LVEF、LVFS以及血清LDH均無 明顯 差異（P＞0.05，見圖2）。

圖1姜黃素和3-TYP 預(yù)處理對(duì)膿毒癥小鼠心肌組織SIRT3信號(hào)通路的影響

圖2姜黃素和3-TYP 預(yù)處理對(duì)膿毒癥小鼠心臟功能和血清LDH含量的影響

2.3 姜黃素預(yù)處理抑制膿毒癥小鼠心肌內(nèi)ROS產(chǎn)量，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量CLP 術(shù)后2 d通過心肌組織冰凍切片DHE染色檢測(cè)各組小鼠心肌組織內(nèi)ROS的產(chǎn)量，通過ELISA法檢測(cè)心肌組織過氧化產(chǎn)物MDA含量。與Sham組小鼠相比，單純給予姜黃素預(yù)處理不影響心肌組織ROS產(chǎn)量和MDA含量（P＞0.05）。而與CLP 組小鼠相比，Cur+CLP 組小鼠心肌組織ROS產(chǎn)量和MDA含量均明顯增高（P＜0.05）。與Cur+CLP 組小鼠相比，3-TYP+Cur+CLP 組小鼠心肌組織ROS產(chǎn)量和MDA含量均明顯降低（P＜0.05）。3-TYP+CLP 組與CLP 組小鼠相比，心肌組織ROS產(chǎn)量和MDA含量均無明顯差異（P＞0.05，見圖3）。

2.4 姜黃素預(yù)處理降低膿毒癥小鼠凋亡率、Bax 和Caspase 3表達(dá)量，提高Bcl-2表達(dá)CLP 術(shù)后2 d

通過TUNEL 染色法檢測(cè)各組小鼠心肌凋亡情況，通過Western Blotting 檢測(cè)心肌組織Bax、Bcl-2和Caspase 3表達(dá)情況。與Sham組小鼠相比，單純給予姜黃素預(yù)處理對(duì)于心肌凋亡率、Bax、Bcl-2和Caspase 3表達(dá)量均無明顯影響（P＞0.05）。與Sham 組小鼠相比，CLP 術(shù)后2 d 小鼠心肌Bcl-2 表達(dá)量明顯降低，而心肌凋亡率、Bax 和Caspase 3表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）。而與CLP 組小鼠相比，Cur+CLP 組小鼠心肌Bcl-2表達(dá)量明顯增高，而心肌凋亡率、Bax 和Caspase 3表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。與Cur+CLP 組小鼠相比，3-TYP+Cur+CLP組小鼠心肌Bcl-2表達(dá)量明顯降低，而心肌凋亡率、Bax 和Caspase 3表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）。3-TYP+CLP 組與CLP 組小鼠相比，心肌凋亡率、Bax、Bcl-2和Caspase 3表達(dá)量均無明顯差異（P＞0.05，見圖4）。

3 討論

嚴(yán)重的膿毒癥和感染性休克是全世界范圍的重要醫(yī)療問題之一，而膿毒癥誘導(dǎo)的心功能障礙是導(dǎo)致膿毒癥患者預(yù)后不良甚至死亡的主要原因［14］。有研究證實(shí)，膿毒癥患者的心臟功能障礙發(fā)生率超過40%，伴隨心臟功能障礙的膿毒癥患者死亡率高達(dá)70%［15］。因此，尋找有效藥物預(yù)防和緩解膿毒癥誘發(fā)的心臟功能障礙對(duì)于提高膿毒癥患者的生存率，改善生活質(zhì)量有非常重要的臨床意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可明顯減輕心肌缺血再灌注損傷［4］、心肌梗死［5］、化療藥物多柔比星誘發(fā)的心肌細(xì)胞損傷［6］、異丙腎上腺素引起的缺血性心肌損傷［16］、心肌肥厚［17］等心血管疾病。此外，姜黃素也可改善不同因素誘發(fā)的膿毒癥心肌損傷。Yang等［3］研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理可顯著降低盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠血漿中肌鈣蛋白I和MDA水平，增加盲腸結(jié)扎穿孔后心肌SOD水平，增強(qiáng)心肌收縮力，減輕心肌炎癥和結(jié)構(gòu)損傷。Wang 等［18］證實(shí)，姜黃素可以通過抑制白介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子和IL-1β炎性因子的表達(dá)，抑制心肌炎癥反應(yīng)，改善脂多糖誘導(dǎo)的心肌損害。與以往研究相一致的是，本實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)，姜黃素預(yù)處理可以有效改善膿毒癥引起的心臟功能損害，降低ROS產(chǎn)量和MDA 含量，降低心肌細(xì)胞凋亡率，抑制促凋亡分子Bax 和凋亡執(zhí)行分子Caspase 3的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡分子Bcl-2的表達(dá)。特別值得注意的是，姜黃素心肌保護(hù)作用的發(fā)揮伴隨SIRT3信號(hào)通路的激活。

圖3姜黃素和3-TYP 預(yù)處理對(duì)膿毒癥小鼠心臟氧化應(yīng)激的影響

圖4姜黃素和3-TYP 預(yù)處理對(duì)膿毒癥小鼠心肌凋亡的影響

SIRT3是線粒體內(nèi)最主要的去乙?；?，其活性與Sirtuin 家族其他成員一樣依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）［13］。SIRT3可通過去乙?；揎椂喾N靶蛋白參與調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。SOD2是位于線粒體中一種重要的抗氧化酶，也是SIRT3在抗氧化應(yīng)激作用中研究最多的靶蛋白之一［19］。SIRT3主要通過去乙?；揎桽OD2，從而增加SOD2 清除ROS的能力［20］。充分證據(jù)表明，上調(diào)SIRT3的表達(dá)或活性是改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的組織損傷的有效策略。例如，白藜蘆醇可通過上調(diào)SIRT3表達(dá)減少H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和ROS產(chǎn)量［21］。褪黑素通過增強(qiáng)SIRT3活性抑制氧化應(yīng)激損傷，從而改善衰老誘導(dǎo)的生育能力下降［22］。阿卡地新（AMPK 激動(dòng)劑）或乙?；?1-肉堿（一種抗氧化劑）治療通過恢復(fù)SIRT3的表達(dá)和活性，抑制線粒體氧化應(yīng)激損傷，最終減輕順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷［23］。此外，SIRT3也是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子。SIRT3過表達(dá)可激活NF-κB，增加Bcl-2／Bax比，并保護(hù)H9c2細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［21］。SIRT3可以直接結(jié)合和去乙酰化Ku70，促進(jìn)Ku70與促凋亡蛋白Bax 相互作用，阻礙Bax 易位至線粒體并最終發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用［24］。值得注意的是，提高SIRT3的表達(dá)和活性已被證實(shí)能有效緩解膿毒癥引起的其他器官損傷。Xu等［8］發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過激活SIRT3／SOD2信號(hào)通路改善膿毒癥引起的急性腎損傷。Sun等［7］發(fā)現(xiàn)，增加SIRT3表達(dá)可通過去乙?；疌ypD，減輕認(rèn)知障礙和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)線粒體膜的完整性，從而緩解膿毒癥腦病誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠與假手術(shù)組小鼠相比，心肌組織內(nèi)SIRT3的表達(dá)明顯降低，伴隨SIRT3下游分子SOD2的乙?；矫黠@提高。以上結(jié)果強(qiáng)烈提示，SIRT3信號(hào)通路受損可能是膿毒癥誘導(dǎo)心肌損傷的潛在機(jī)制，而激活SIRT3信號(hào)通路可能是緩解膿毒癥心肌損傷的新策略。

近年來，越來越多的研究顯示，姜黃素具有強(qiáng)效抗氧化應(yīng)激損傷和抗細(xì)胞凋亡作用。姜黃素可減輕心肌缺血再灌注［25］、多柔比星心臟毒性［6］、機(jī)械創(chuàng)傷［26］等疾病狀態(tài)下心肌氧化應(yīng)激損傷和心肌凋亡。在本研究中發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠心肌組織內(nèi)ROS產(chǎn)量和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增加，而姜黃素預(yù)處理可以明顯降低心肌ROS產(chǎn)量和MDA含量，即姜黃素預(yù)處理能夠有效抑制膿毒癥引起的心肌氧化應(yīng)激損傷。此外，膿毒癥小鼠心肌組織凋亡率明顯增加，伴隨心肌促凋亡蛋白Bax和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase 3的表達(dá)量明顯增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量明顯降低。姜黃素預(yù)處理可以明顯降低凋亡率、Bax 和Caspase 3的表達(dá)量，提高Bcl-2 的表達(dá)水平，即姜黃素預(yù)處理能明顯緩解膿毒癥引起的心肌細(xì)胞凋亡。如前所述，SIRT3具有抗氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡生物活性。姜黃素預(yù)處理可以明顯激活SIRT3信號(hào)通路，而抑制SIRT3信號(hào)通路后，姜黃素緩解膿毒癥心臟功能障礙、氧化應(yīng)激損傷和心肌細(xì)胞凋亡的作用均明顯減弱。綜上，姜黃素抗膿毒癥心肌損傷的作用主要由SIRT3信號(hào)通路介導(dǎo)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素預(yù)處理可通過抑制氧化應(yīng)激損傷和心肌細(xì)胞凋亡抑制膿毒癥引起的心肌損害，且上述保護(hù)作用主要由SIRT3信號(hào)介導(dǎo)。本研究為臨床上應(yīng)用姜黃素治療膿毒癥心肌病提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。