FoxO1過表達(dá)對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制

魯莉，潘虹，石朋飛

武漢市中心醫(yī)院，武漢430014

甲狀腺癌是一種內(nèi)分泌惡性腫瘤，可分為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、濾泡性甲狀腺癌、髓樣甲狀腺癌和未分化間變性甲狀腺癌[1]。其中PTC占所有甲狀腺惡性腫瘤的80%[2，3]。PTC的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，探索PTC發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制可能為臨床治療提供新的思路。轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白O1(FoxO1)是FOXO家族的重要成員之一，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期控制、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、代謝和DNA損傷修復(fù)等多種功能調(diào)控[4]。研究顯示，F(xiàn)oxO1在許多人類惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，包括乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤等[5～7]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路已被證明在PTC的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用[8，9]。FoxO1的活性受PI3K/Akt通路調(diào)控。PI3K/Akt在多個(gè)位點(diǎn)磷酸化FoxO1，使FoxO1進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而降低其轉(zhuǎn)錄活性[10]。Bim是PI3K/Akt信號通路的下游靶點(diǎn)，Bim是Bcl-2家族中僅含一個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白，具有促凋亡活性，參與多種不同類型細(xì)胞的凋亡調(diào)控。2018年7月～2019年3月，本研究觀察了過表達(dá)FoxO1對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞KTC-1增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，并初步探討了相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株KTC-1(上海中科院細(xì)胞庫)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素(美國Gibco公司)；FoxO1過表達(dá)慢病毒載體pLV-FoxO1、空載體pLV-control(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天公司)；PI單染細(xì)胞周期檢測試劑盒(上海凱基公司)；全蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗人FoxO1、PI3K、Akt、p-Akt(ser473)、Bim及GAPDH一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(英國Abcam公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能公司)。

1.2 細(xì)胞分組及慢病毒轉(zhuǎn)染 取處于對數(shù)生長期的KTC-1細(xì)胞并用胰酶消化處理，離心收集后，以1.0×105/mL將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中并接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)40%。隨機(jī)將6孔細(xì)胞分成對照組和過表達(dá)組，每組3個(gè)平行復(fù)孔。對照組感染pLV-Control慢病毒，過表達(dá)組感染pLV-FoxO1慢病毒(感染復(fù)數(shù)值均為100)。感染72 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，當(dāng)熒光表達(dá)率大于90%時(shí)，提取兩組細(xì)胞總蛋白，Western blotting法檢測FoxO1蛋白。過表達(dá)組FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于對照組(分別為0.67±0.08、0.24±0.05，P<0.05)，提示FoxO1基因在KTC-1細(xì)胞成功過表達(dá)。

1.3 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖能力。①M(fèi)TT法：將兩組細(xì)胞以1.0×104/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，記錄0 h時(shí)細(xì)胞在490 nm處的光密度值(OD值)；在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，按MTT試劑盒說明操作，測量各孔細(xì)胞在490 nm處的OD值。細(xì)胞增殖率=(OD48 h-OD0 h)/OD0 h×100%。②克隆形成實(shí)驗(yàn)：將兩組細(xì)胞以胰酶消化后重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，以100/皿分別接種于含37 ℃預(yù)溫培養(yǎng)液(10 mL)的培養(yǎng)皿中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻；置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，期間每3 d觀察一次細(xì)胞生長狀況并換液；當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)；棄去上清液，用PBS浸洗2次，加5 mL的4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，去固定液，結(jié)晶紫染液染色10～30 min，流水緩慢洗去染色液，干燥后觀察拍照，計(jì)算克隆形成數(shù)。

1.4 細(xì)胞凋亡情況觀察 采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡。取兩組細(xì)胞以1.0×104/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，共培養(yǎng)48 h。按照Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒說明操作：1 000 g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞；加入1 mL預(yù)冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1 000 g、4 ℃離心5 min，棄上清，重復(fù)2次；將細(xì)胞重懸于200 μL的Binding buffer；加入10 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI，輕輕混勻，4 ℃避光孵育30 min；加入300 μL的Binding Buffer，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，使用CXP軟件分析并記錄結(jié)果。凋亡率=第二象限B2細(xì)胞占比+第四象限B4細(xì)胞占比。

1.5 細(xì)胞周期分布觀察 PI單染檢測細(xì)胞周期。取兩組細(xì)胞以1.0×104/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，共培養(yǎng)48 h。按照PI細(xì)胞周期流式檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作：收集細(xì)胞，胰蛋白酶消化；用1×PBS溶液浸洗2次，移至1.5 mL離心管中；加入冰冷70%乙醇3 mL固定細(xì)胞，4 ℃放置24 h；用冷PBS清洗細(xì)胞2次，1 000 g離心5 min，棄上清；加入1 mL的PI染液(含RNase)，輕輕震蕩混勻，室溫下避光放置30 min；用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測；CXP軟件分析并記錄結(jié)果。

1.6 PI3K/Akt/Bim信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。收集培養(yǎng)48 h后的各組細(xì)胞，采用全蛋白提取試劑盒提取蛋白。用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白和4 μL的2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100 ℃變性10 min。上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。PBS洗膜后，分別加入一抗(PI3K、p-Akt、Akt、Bim和內(nèi)參GAPDH，稀釋比均為1∶1 000)4 ℃孵育過夜。PBS洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育0.5 h。PBS洗膜，ECL試劑顯色。采用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖能力比較 過表達(dá)組、對照組細(xì)胞增殖率分別為33.21%±6.78%、79.37%±8.49%，克隆形成數(shù)分別為(28.67±4.50)、(66.33±7.36)個(gè)/皿。過表達(dá)組細(xì)胞增殖率、克隆形成數(shù)均低于對照組(P均<0.05)。

2.2 兩組細(xì)胞凋亡率比較 過表達(dá)組、對照組細(xì)胞總凋亡率分別為69.47%±12.35%、27.22%±6.49%，過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率高于對照組(P<0.05)。

2.3 兩組細(xì)胞周期分布比較 過表達(dá)組、對照組G0/G1期細(xì)胞比例分別為79.57%±10.34%、51.26%±8.41%，過表達(dá)組G0/G1期細(xì)胞比例高于對照組(P<0.05)。

2.4 兩組細(xì)胞中PI3K/Akt/Bim信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 過表達(dá)組PI3K蛋白表達(dá)及p-Akt/Akt水平低于對照組，Bim蛋白表達(dá)高于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組細(xì)胞中PI3K/Akt/Bim信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討論

PTC是臨床甲狀腺癌最常見的類型，目前臨床治療PTC的主要方法是手術(shù)切除[11]。遺傳學(xué)改變是PTC發(fā)生、發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)力之一，如RAS、B-Raf原癌基因突變被認(rèn)為與PTC的臨床參數(shù)(進(jìn)展、侵襲和復(fù)發(fā))之間存在重要關(guān)聯(lián)[12]。更多參與PTC進(jìn)展的新靶點(diǎn)需要被發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)可作為診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，并為治療PTC提供依據(jù)。先前證據(jù)表明，F(xiàn)oxO1在包括PTC在內(nèi)的許多人類正常組織和腫瘤組織中均有差異表達(dá)[5，6]。在宮頸癌中，F(xiàn)oxO1被證明通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯和凋亡抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。然而，F(xiàn)oxO1在人PTC發(fā)生中的作用機(jī)制尚不清楚。

為了觀察FoxO1過表達(dá)對PTC的影響，我們在PTC細(xì)胞株KTC-1中感染了FoxO1過表達(dá)的慢病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FoxO1蛋白的表達(dá)量顯著提升；且FoxO1表達(dá)上調(diào)可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，經(jīng)典霍奇金淋巴瘤相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)活躍的FoxO1異位表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻止其增殖，并伴隨著顯著的G0/G1期細(xì)胞阻滯[14]。此外，F(xiàn)oxO1在人非小細(xì)胞肺癌中顯著低表達(dá)，F(xiàn)oxO1過表達(dá)增加了腫瘤細(xì)胞表面微絨毛的長度，進(jìn)而抑制其遷移；FoxO1沉默則顯著縮短了微絨毛的長度，促進(jìn)細(xì)胞遷移。這提示FoxO1同樣參與人肺癌的發(fā)生。在人骨肉瘤細(xì)胞中，研究者發(fā)現(xiàn)FoxO1通過MALAT1的負(fù)調(diào)控抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，上調(diào)FoxO1表達(dá)可作為骨肉瘤患者的一種替代治療策略[15]。同樣，人肝癌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1在肝癌組織中顯著低表達(dá)，F(xiàn)oxO1相關(guān)信號通路激活劑甲哌氟丙嗪能促進(jìn)SMMC-7721、Bel-7402細(xì)胞株凋亡，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其機(jī)制與增加細(xì)胞核中FoxO1的表達(dá)及調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比例有關(guān)[16]。以上研究提示，F(xiàn)oxO1是包括PTC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的抑癌基因，其表達(dá)調(diào)控可作為腫瘤分子治療的重要途徑。

現(xiàn)已證實(shí)，PI3K/Akt信號通路參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)調(diào)控。研究表明，F(xiàn)oxO1的活性受PI3K/Akt信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)。研究者使用Akt抑制劑處理甲狀腺癌細(xì)胞24 h后，發(fā)現(xiàn)FoxO1蛋白的表達(dá)水平顯著升高，提示PI3K的激活下調(diào)FoxO1蛋白的表達(dá)水平。鼻咽癌相關(guān)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO1通過PI3K/AKT/C-JUN信號通路誘導(dǎo)miR-3188的表達(dá)并抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖[17]。宮頸癌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑LY294002顯著降低了PI3K磷酸化水平，但激活了FoxO1轉(zhuǎn)錄因子，而FoxO1的激活誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖[13]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)組PI3K蛋白表達(dá)及p-Akt/Akt水平低于對照組，表明上調(diào)FoxO1表達(dá)對PI3K/Akt信號通路具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)在Akt磷酸化水平的降低。細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，這一生物學(xué)過程受到多種基因的影響。Bcl-2家族是研究最多的一類凋亡相關(guān)蛋白[18]。Bim不僅是PI3K/Akt信號通路的下游靶點(diǎn)，也是Bcl-2家族的成員之一。Bim轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控十分復(fù)雜，可受到多種信號途徑的調(diào)節(jié)，其中包括PI3K/Akt信號通路。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，p-Akt活性抑制劑LY294002能促進(jìn)Bim蛋白表達(dá)，提示Bim蛋白表達(dá)可能通過PI3K/AKT信號通路來調(diào)控[19]。低溫致乳鼠心肌細(xì)胞損傷的相關(guān)研究表明，低溫能夠通過促進(jìn)Bim表達(dá)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而PI3K/AKT信號通路同樣可能參與了Bim的誘導(dǎo)表達(dá)[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)組Bim蛋白表達(dá)高于對照組，表明外源性的FoxO1上調(diào)同樣增加了Bim蛋白的表達(dá)水平。FoxO1過表達(dá)可能通過調(diào)控PI3K/Akt/Bim信號通路影響PTC細(xì)胞的增殖、凋亡。

綜上所述，F(xiàn)oxO1過表達(dá)后PTC細(xì)胞增殖能力降低、凋亡水平升高、G0/G1期阻滯細(xì)胞明顯增多，其作用機(jī)制可能涉及PI3K/Akt/Bim信號通路的活性調(diào)控。更加詳細(xì)的分子生物學(xué)機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入探討。