金剛藤對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響

文一惠，凌江紅，，叢軍，李莉

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021；2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院

原發(fā)性肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。原發(fā)性肝癌中最為常見的是肝細(xì)胞肝癌(HCC)，占80%～90%[1]。目前，HCC的治療主要有外科手術(shù)、消融治療、介入治療、化療、靶向治療、免疫治療、中醫(yī)藥治療等。在HCC發(fā)病早期，首要治療手段是肝臟切除，但大部分HCC臨床確診時(shí)已達(dá)中晚期，僅有20%的HCC患者有機(jī)會接受手術(shù)治療，術(shù)后仍有腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等不利因素[2，3]。消融治療、介入治療是基于腫瘤定位及較小腫瘤有效的治療手段。大部分傳統(tǒng)化療藥不良反應(yīng)較多，易產(chǎn)生耐藥[4，5]。而靶向治療及免疫治療存在個(gè)體差異，且費(fèi)用高昂。因此，尋找療效穩(wěn)定且不良反應(yīng)小的治療藥物有重要意義。金剛藤為百合科菝葜屬植物的干燥根莖，具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹、解毒散瘀的功效，臨床上常用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、盆腔炎等疾病。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)金剛藤具有良好的抗腫瘤作用[6]。2019年1～8月，本研究觀察了不同濃度金剛藤對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，進(jìn)一步探討金剛藤的抗肝癌作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、細(xì)胞及主要材料 SPF級SD大鼠購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證編號為SCXK(滬)2018-0004，雌雄不限，鼠齡8～10周，共16只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)，喂養(yǎng)期間大鼠自由進(jìn)食、水。人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株由上海中科院細(xì)胞庫提供。將SMMC-7721細(xì)胞按1×106/板接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、恒溫恒濕條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換液傳代1次。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。中藥金剛藤購自廣西民族醫(yī)藥研究所，產(chǎn)地廣西，批號為161201，由桂林鼎康中藥飲片有限公司生產(chǎn)。DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗混合液、胎牛血清購自美國GIBCO公司。Apoptosis Detection Kit購自上海翊圣生物科技有限公司。CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。多功能酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 金剛藤水煎液及含藥血清的制備 ①金剛藤水煎液的制備：200 g金剛藤飲片，加水至高出藥物表面2～3 cm處，浸泡2 h武火煮沸后改用文火煎煮30 min，冷卻，過濾取汁(濾液1)，濾渣如上法再煎2次，得到濾液2、濾液3，混合3次得到的藥液，濃縮至100 mL，得到2 g/mL的藥液，4 ℃保存?zhèn)溆?。②含藥血清的制備：SPF級SD大鼠16只，隨機(jī)分為空白組(Control組)、金剛藤低劑量組(JGT-L組)、金剛藤中劑量組(JGT-M組)和金剛藤高劑量組(JGT-H組)，每組4只；JGT-L組、JGT-M組、JGT-H組大鼠分別以0.5、1、2 g/mL的金剛藤水煎液灌胃、每次4 mL，Control組給予等體積生理鹽水灌胃，每天灌胃2次、間隔12 h，連續(xù)給藥3 d；末次給藥1 h后以CO2窒息法處死小鼠，心臟取血，靜置后離心15 min取血清，合并同組血清，過濾、滅活除菌后得到含藥血清，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞分組及給藥方法 取對數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞分為Control組、JGT-L組、JGT-M組、JGT-H組，用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，加入96孔培養(yǎng)板、每孔0.1 mL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞貼壁達(dá)到70%～80%時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液。JGT-L組、JGT-M組、JGT-H組、Control組分別加入0.5、1、2 g/mL的含藥血清4 mL和等量生理鹽水。

1.4 細(xì)胞增殖能力觀察 分別于培養(yǎng)12、24、48 h后行CCK-8實(shí)驗(yàn)。每組重復(fù)6個(gè)副孔，每孔分別加入10 μL的CCK-8，繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔的光密度值(OD值)，表示細(xì)胞增殖能力。

1.5 細(xì)胞凋亡率測算 培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，去除培養(yǎng)基。用PBS清洗1次后，空白血清組重懸于1×Binding Buffer(400 μL)，金剛藤含藥血清組重懸于1×Binding Buffer(100 μL)中。取出100 μL上述溶液至流式管中，分別加5 μL的FITC-Annexin Ⅴ和5 μL的Propidum Iodide。輕柔彈起混勻，室溫(25 ℃)避光孵育15 min。向每管中加入400 μL的1×Binding Buffer，混勻。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6 細(xì)胞周期檢測 培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，去上清。用PBS洗2次，邊振蕩邊加-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇1 mL，4 ℃固定30 min或-20 ℃固定過夜，直至進(jìn)行DNA染色。染色時(shí)取出標(biāo)本，于1 000 r/min離心5 min，將乙醇吸除，加PBS清洗固定液1～2次后，1 000 r/min離心5 min，棄上清。吸除離心管內(nèi)PBS，加入200 μL的PBS和2 μL的RNA酶(0.25 mg/mL)，37 ℃孵育30 min，加入PI(50 μg/mL)5 μL室溫(25 ℃)避光反應(yīng)30 min。用流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1 金剛藤對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響 各金剛藤藥物組相同作用時(shí)間下細(xì)胞增殖能力均低于Control組(P均<0.05)；JGT-L組、JGT-M組、JGT-H組細(xì)胞增殖能力逐漸減弱，組間兩兩相比，P均<0.05。見表1。

表1 各組SMMC-7721細(xì)胞增殖能力比較

注：與同時(shí)點(diǎn)Control組比較，*P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)JGT-L組比較，#P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)JGT-M組比較，△P<0.05。

2.2 金剛藤對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響 Control組、JGT-L組、JGT-M組、JGT-H組細(xì)胞凋亡率分別為5.48%±0.13%、6.86%±0.69%、8.75%±0.22%、9.80%±0.35%。各金剛藤藥物組細(xì)胞凋亡率均高于Control組(P均<0.05)；JGT-L組、JGT-M組、JGT-H組細(xì)胞凋亡率逐漸升高，兩兩相比，P均<0.05。

2.3 金剛藤對SMMC-7721細(xì)胞周期的影響 JGT-M組、JGT-H組G0/G1期細(xì)胞比例高于Control組(P均<0.05)；JGT-L組S期細(xì)胞比例高于Control組，JGT-M組、JGT-H組S期細(xì)胞比例低于JGT-L組，JGT-H組S期細(xì)胞比例低于Control組(P均<0.05)；JGT-L組、JGT-M組G2/M期細(xì)胞比例低于Control組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組SMMC7721細(xì)胞周期分布比較

注：與Control組比較，*P<0.05；與JGT-L組比較，#P<0.05。

3 討論

金剛藤味微辛，性溫，歸肝腎經(jīng)，可以利濕去濁、祛風(fēng)除痹、解毒散瘀，治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、盆腔炎等。近年來發(fā)現(xiàn)，金剛藤對腫瘤具有很好的抑制作用，在臨床上取得了一定療效。王靜等[7]發(fā)現(xiàn)，復(fù)方菝葜顆粒聯(lián)合髂內(nèi)動脈栓塞灌注化療治療局部晚期宮頸癌療效較好，可有效減少不良反應(yīng)，增強(qiáng)患者免疫功能。有學(xué)者[8，9]發(fā)現(xiàn)復(fù)方菝葜顆粒治療中晚期非小細(xì)胞肺癌有一定療效，有望延長肺癌患者的生存期，提高生活質(zhì)量。另外，還有多項(xiàng)基礎(chǔ)研究證實(shí)了金剛藤的抗腫瘤作用。Nambiar等[10]發(fā)現(xiàn)，金剛藤的成分水飛薊賓能使腫瘤細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗胰腺癌活性。Fu等[11]研究表明，金剛藤可通過線粒體途徑誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡。Yu等[12]發(fā)現(xiàn)金剛藤的甲醇提取物能夠通過ERK途徑誘導(dǎo)人口腔癌MC-3細(xì)胞凋亡。本課題組前期檢測10種壯藥含藥血清對SMMC-7721細(xì)胞生長的抑制情況，觀察到金剛藤、藤梨根、葉下珠、半枝蓮可抑制肝癌細(xì)胞增殖，其中金剛藤對SMMC-7721細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)[6]。所以,本實(shí)驗(yàn)以SMMC-7721細(xì)胞為研究對象，觀察金剛藤對其增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。

一系列基因精密調(diào)控著細(xì)胞的增殖，失去基因的正常調(diào)控后，細(xì)胞可無限增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)病[13]。抑制腫瘤細(xì)胞增殖，能夠延緩腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。吳先闖等[14]采用MTT法檢測菝葜提取分離的乙醇粗提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位對肝癌細(xì)胞H22、HepG-2、BEL-7402體外生長抑制情況，結(jié)果顯示4種提取部位均有不同程度的抗肝癌細(xì)胞活性，其中乙酸乙酯部位抑制細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴性。本研究結(jié)果顯示，金剛藤對SMMC-7721細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，隨著金剛藤濃度增加，其抑制效果更顯著，與相關(guān)研究結(jié)果一致。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一系列內(nèi)源性基因的調(diào)控下發(fā)生的自然或生理性死亡的過程，是機(jī)體維持生理活動所必需的。細(xì)胞凋亡障礙會誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。Hu等[16]研究表明，金剛藤可通過激活Caspase-3、PARP和Bax誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)錄，下調(diào)Bcl-2、Bcl-XL、cIAP-1、XIAP和AKT表達(dá)，誘導(dǎo)卵巢癌A2780細(xì)胞凋亡。廖子君等[17]發(fā)現(xiàn)菝葜皂苷能夠上調(diào)胃癌BGC-823細(xì)胞Bax蛋白水平、下調(diào)Bcl-2蛋白水平，從而誘導(dǎo)其凋亡。何萍等[18]研究顯示，菝葜、紅藤、藤梨根三藥聯(lián)合使用可增強(qiáng)對人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抗癌作用，可能與活化Caspase-3有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，金剛藤對SMMC-7721細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用，隨著金剛藤濃度增加，SMMC-7721細(xì)胞凋亡率逐漸增高，證實(shí)了金剛藤可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡有關(guān)，也與細(xì)胞周期關(guān)系密切。細(xì)胞周期的調(diào)控在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中同樣起著關(guān)鍵作用。細(xì)胞周期調(diào)控紊亂將導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞失控性增殖[19]。于麗秀等[20]觀察了菝葜對乳腺癌A2780、HO8910PM細(xì)胞存活的影響，發(fā)現(xiàn)菝葜的對兩種卵巢癌細(xì)胞均有抑制作用，抑制作用呈劑量及時(shí)間依賴性。有研究發(fā)現(xiàn)金剛藤的成分水飛薊賓能使胰腺癌細(xì)胞阻滯于G1期[10]。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，金剛藤對SMMC-7721細(xì)胞周期具有阻滯作用，其中JGT-M組、JGT-H組主要將細(xì)胞阻滯在G1期，提示金剛藤可調(diào)控肝癌細(xì)胞周期，這與相關(guān)研究[10]結(jié)果一致。

綜上所述，金剛藤可抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，相關(guān)機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。