構(gòu)建酶敏感型嵌合肽用于腫瘤光動(dòng)力學(xué)治療*

田 翔，程崟家，張愛清

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，武漢 4330074)

0 引 言

癌癥是當(dāng)今世界上大多數(shù)國家非常棘手的一大難題。目前傳統(tǒng)的癌癥治療方法有化療、放療、和手術(shù)切除法。但是以上方法各有利弊，例如：在傳統(tǒng)的化療過程中，由于抗癌藥物本身缺乏對癌細(xì)胞的治療特異性，因此在治療腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會對正常細(xì)胞造成損傷；放療的治療設(shè)備昂貴，其中的射線對病人的身體往往會造成很大的傷害；手術(shù)切除法雖然能夠去掉比較大的腫瘤，但是對于頭部腫瘤和心臟腫瘤等，手術(shù)難度極大，風(fēng)險(xiǎn)太高。隨著科技的發(fā)展，出現(xiàn)許多新型的癌癥治療方式，如光動(dòng)力治療(PDT)[1]、光熱治療、基因治療和免疫治療等。其中，PDT主要利用特定光誘導(dǎo)光敏劑產(chǎn)生活性氧簇(ROS)，通過ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死，這種新型癌癥治療手段相較于傳統(tǒng)的癌癥治療手段，具有一系列優(yōu)勢，包括對表面皮膚腫瘤的高效性和無創(chuàng)性，利用光控制的對腫瘤區(qū)域和時(shí)間的可選擇性，以及可以重復(fù)治療的特性，因此在腫瘤高效治療方面獲得巨大優(yōu)勢。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2-5]，單線態(tài)氧作為ROS家族中的成員，能夠破壞腫瘤血管，激活針對腫瘤的免疫反應(yīng)，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但是單線態(tài)氧的半衰期短(<40 ns)，作用范圍有限(<20 nm)[6-7]。此外，常用的光敏劑如原卟啉(PpIX)、二氫卟吩等，雖然在特定波長的光照下能夠產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧(1O2)，從而發(fā)揮PDT效應(yīng)，但是其在水中的溶解性較差，不能有效靶向到腫瘤區(qū)域，因此嚴(yán)重影響其在生物體內(nèi)進(jìn)一步發(fā)揮PDT治療的效果。針對以上問題，如何將光敏劑運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞及其亞細(xì)胞器內(nèi)，進(jìn)而有效提高PDT的治療效果的策略正在被廣泛研究[6,8-11]。

本文設(shè)計(jì)并合成了一種能夠靶向進(jìn)入癌細(xì)胞線粒體的兩親性嵌合肽 PpIX-GGK(TPP)G-GFLG-R8GD(PTGR)，利用其在水溶液中能夠發(fā)生自組裝行為，從而得到以疏水性光敏劑為內(nèi)核，親水性多肽為外殼的兩親性前藥膠束，實(shí)現(xiàn)對疏水性光敏劑PpIX的有效負(fù)載。該前藥膠束主要利用靶向肽RGD特異性識別整合素αvβ3受體過度表達(dá)的HeLa細(xì)胞，并在R8肽的協(xié)助下快速穿膜進(jìn)入細(xì)胞。在癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)過度表達(dá)的組織蛋白酶B的作用下，GFLG肽能夠發(fā)生特異性酶解斷裂[12]，從而導(dǎo)致膠束結(jié)構(gòu)遭到破壞。在特定光照下，修飾在多肽側(cè)鏈上的三苯基膦(TPP)能協(xié)助光敏劑PpIX有效富集在癌細(xì)胞線粒體周圍，并產(chǎn)生大量活性氧，從而破壞癌細(xì)胞線粒體，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或壞死。本文設(shè)計(jì)的嵌合肽具有較好的生物相容性和生物降解性，能夠避免不良的免疫反應(yīng)。此外，該兩親性嵌合肽可以提高將光敏劑靶向運(yùn)輸?shù)桨┘?xì)胞及其亞細(xì)胞器的能力，進(jìn)而有效提高腫瘤的PDT治療效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

二甲基亞砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、甲醇、哌啶、二異丙基乙胺(DIEA)、三異丙基硅烷(TIS)、乙醚、水合肼、三氟乙酸、氫氧化鈉、無水硫酸鎂，國藥基團(tuán)化學(xué)試劑公司；Fmoc-Lys(Dde)-OH(K)、Fmoc-Gly-OH(G)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(R)、Fmoc-Leu-OH(L)、Fmoc-Phe-OH(F)、Fmoc-Lys(Dde)-OH(K)、Fmoc-Asp(OtBu)-OH(D)、1-羥基苯并三氮唑(HOBt)、苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、2-氯-三苯甲基氯樹脂(2-Chlorotrityl chloride resin)，上海吉爾生化公司；2，7-二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA)，碧云天生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、胎牛血清(FBS)，Gibco公司；噻唑藍(lán)(MTT), Geneview公司；4-羧丁基三苯基溴化膦(TPP)、原卟啉(PpIX)，阿拉丁試劑有限公司。

熒光分光光度計(jì)(RF-5301 PC，日本島津公司)；紫外分光光度計(jì)(Lambda Bio 40，美國鉑金埃爾默公司)；超分辨顯微鏡(德國徠卡公司)；納米粒度電位儀(Nano ZS ZEN3600，英國馬爾文公司)；透射式電子顯微鏡(Tecnai G2 F20 S-TWIN，美國FEI公司)；基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF，美國布魯克·道爾頓公司)。

1.2 合成與表征

1.2.1 PTGR的合成

PTGR的合成路線如圖1所示。取三苯甲基氯樹脂(0.8 g，0.97 mmol/g)于多肽固相合成柱中，加入適量DMF進(jìn)行溶脹45 min，溶脹結(jié)束后進(jìn)行抽濾。向多肽固相合成柱中加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3當(dāng)量)和DIEA(6當(dāng)量)的DMF混合液，反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后抽出濾液，并用DMF洗滌4次。然后向多肽固相合成柱中加入含有30%哌啶的DMF溶液反應(yīng)10 min，抽取濾液，脫除FMOC保護(hù)基團(tuán)。隨后向多肽固相合成柱中加入Fmoc-Gly-OH(2當(dāng)量)，HBTU(2.4當(dāng)量)，HOBt(2.4當(dāng)量)和DIEA(2 mL)的DMF混合液，反應(yīng)2 h，進(jìn)行抽濾，并用DMF洗滌數(shù)次。重復(fù)以上脫保護(hù)、洗滌和縮合步驟，至合成的嵌合肽序列為PpIX-GGK(Dde)G-GFLG-R8GD。接著向固相合成柱中加入含有20%水合肼的DMF溶液反應(yīng)5 min，抽取濾液，重復(fù)反應(yīng)8次，脫去Dde保護(hù)基團(tuán)，用DMF洗滌數(shù)次至水合肼被完全洗掉。加入4-羧丁基三苯基溴化膦(4當(dāng)量)，HBTU(4.8當(dāng)量)，HOBt(4.8當(dāng)量)和DIEA(2 mL)的DMF混合液，反應(yīng)2 h后抽濾。然后用DMF、甲醇、二氯甲烷洗滌數(shù)次，真空干燥。干燥后，向反應(yīng)器中加入切落劑(體積占比為95% TFA、2.5% H2O、2.5% TIS)反應(yīng)100 min后，收集濾液，經(jīng)過旋蒸濃縮后，用冷乙醚沉淀后離心，真空干燥24 h，得到嵌合肽分子。多肽酶解前后的分子量均通過MALDI-TOF測得。

圖1 PTGR的合成路線

1.2.2 PTGR電勢和粒徑的測定

配置100 μg/mL的PTGR水溶液，取1 mL PTGR溶液裝入測試池內(nèi)，使用納米粒度電位儀檢測其電勢和粒徑。

1.2.3 PTGR形貌的觀測

配置150 μg/mL的PTGR水溶液，取10 μL的PTGR溶液滴到銅網(wǎng)上，靜置一段時(shí)間后，用新配好的3%的磷鎢酸水溶液進(jìn)行負(fù)染，用TEM觀測其形貌。

1.2.4 PTGR臨界膠束溶度(CMC)的測定

兩親性嵌合肽膠束的CMC[13-14]是以芘為疏水性熒光探針，由熒光分光光度計(jì)測得。精確稱量9.7 mg芘，使其溶于10 mL丙酮，然后稀釋至4.6×10-6mol/L。向已配好的一系列濃度的3.6 mL PTGR溶液加入45 μL已配好的芘的丙酮溶液。將配置好的樣品放入搖床(150 r/min 37 ℃)震蕩24 h，讓丙酮完全揮發(fā)。利用熒光分光光度計(jì)測定溶液在360～400 nm范圍內(nèi)的激發(fā)光譜，設(shè)定激發(fā)波長為342 nm，發(fā)射光和激發(fā)光的狹縫狹縫寬度均為5 nm。記錄一系列濃度的溶液在393 nm與374 nm處的熒光強(qiáng)度。以兩個(gè)位置的熒光強(qiáng)度比值作為縱坐標(biāo)，以溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，找出兩條直線的交點(diǎn)對應(yīng)的橫坐標(biāo)值，從而計(jì)算得到該膠束的臨界膠束濃度(CMC)。

1.2.5 PpIX紫外標(biāo)曲的測定

配置一系列不同濃度的PpIX的混合溶液(體積占比為1% DMSO、99% H2O)，以純水的紫外可見光吸收光譜為基線，利用紫外分光光度計(jì)檢測PpIX溶液在300～650 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜。記錄一系列濃度梯度的溶液在400 nm處的吸光度，以吸光度的強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)，PpIX溶液的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，從而得到PpIX的紫外標(biāo)曲。

1.2.6 PTGR單線態(tài)氧產(chǎn)生性能表征

通過DCFH-DA檢測混合溶液在光照下525 nm處的熒光值的升高來表征單線態(tài)氧的產(chǎn)生，將DCFH-DA用0.01 mol/L NaOH處理0.5 h使其轉(zhuǎn)化成DCFH。配置兩組100 μg/mL的PTGR水溶液，隨后加入提前處理好的探針DCFH，使DCFH的最終溶度為20 μmol/L。將第一組材料溶液置于680 nm激光(30 mW/cm2)下照射,每隔一定時(shí)間用熒光分光光度計(jì)測定在488 nm激發(fā)波長下，PTGR溶液在525 nm處的熒光強(qiáng)度值。第二組材料在避光條件下重復(fù)上述熒光檢測的方法。

1.2.7 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

(1)共聚焦觀測細(xì)胞對材料的內(nèi)吞

將人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、非洲綠猴腎細(xì)胞(COS 7)分別接種到共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，加入相當(dāng)于5 μg/mL的PpIX的PTGR溶液。培養(yǎng)4 h后，向培養(yǎng)皿中加入Hoechst33324染色30 min，用PBS洗滌培養(yǎng)皿3次，并通過超分辨顯微鏡觀測(激發(fā)波長：488 nm，PpIX接收通道：(630±10)nm。

(2)共聚焦光測材料靶向細(xì)胞線粒體

將人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)接種于共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，加入相當(dāng)于5 μg/mL的PpIX的PTGR 溶液。培養(yǎng)4 h后，向培養(yǎng)皿中加入線粒體染料Mito Tracker Green染色30 min，用PBS洗滌3次，并通過超分辨顯微鏡觀測(激發(fā)波長488 nm，PpIX接收通道(630±10)nm，Mito Tracker Green接收通道(540±10)nm)。

(3)共聚焦觀測細(xì)胞內(nèi)的ROS生成

將HeLa細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，加入含有5 μg/mL的PpIX的PTGR溶液。培養(yǎng)4 h后，加入DCFH，使DCFH在培養(yǎng)皿內(nèi)的最終濃為20 μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)30 min后，在680 nm激光(30 mW/cm2)下照射1 min，用PBS洗滌三次培養(yǎng)皿，并立即通過超分辨顯微鏡觀測(激發(fā)波長488 nm，接收通道(525±10)nm)。

(4)共聚焦光測細(xì)胞線粒體損傷

將HeLa細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，加入相當(dāng)于5 μg/mL的PpIX的PTGR 溶液。培養(yǎng)4 h后，加入染料JC-1染色30min，在680 nm激光(30 mW/cm2)下照射1 min，用PBS洗滌3次，并通過超分辨顯微鏡觀測(激發(fā)波長488 nm，monomeric JC-1接收通道(520±10)nm，aggregated JC-1接收通道(580±10)nm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PTGR的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)表征

如圖2(a)，利用MALDI-TOF對合成的PTGR進(jìn)行了表征。PTGR的理論分子量是3081，MALDI-TOF結(jié)果顯示該材料的分子量為3081，此分子量和理論分子量一致，證明了PTGR的成功合成。如圖2(b)，利用MALDI-TOF對酶解24 h后的PTGR 進(jìn)行表征，與酶解前的相比，新出現(xiàn)了分子量為500、1 284和1 498的3個(gè)峰與PTGR含有的多肽片段LGRR、R7GD和GR8GD分子量相吻合，表明了PTGR 能夠被組織蛋白酶B瓦解。利用TEM觀測PTGR在水溶液中的自組裝形貌，由圖3(a)所示，不難發(fā)現(xiàn)，PTGR通過自組裝形成了尺寸在60 nm左右的球形納米顆粒，分布比較均勻，表明鍵接上PpIX的多肽自組裝結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，具有較好的分散性。此外，利用納米粒度電位儀分別檢測PTGR材料的電勢和粒徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)進(jìn)一步表明PTGR在水中能夠有效組裝成尺寸為140 nm左右的納米粒子，而且表面電勢為+21.1 mV，有助于PTGR快速穿過細(xì)胞膜進(jìn)入癌細(xì)胞。其中，TEM觀測到的納米顆粒尺寸比納米粒度電位儀檢測出的粒徑小，是由于PTGR在TEM測的是其干態(tài)下的納米粒徑，而納米粒度電位儀表征的是其水合粒徑[15]。據(jù)報(bào)道[16]，具有兩親性結(jié)構(gòu)的納米材料在一定濃度的條件下會自組裝形成膠束，同時(shí)將芘包埋在其疏水性內(nèi)核中，從而引起芘的熒光發(fā)生變化。因此，用疏水性的芘做為熒光探針，對PTGR的CMC進(jìn)行測定，如圖3(b)所示，PTGR的CMC值是1.5 μg/mL，表明PTGR在極低的濃度下能夠自組裝形成膠束，且納米膠束的結(jié)構(gòu)緊湊。如圖3(c)所示，利用紫外分光光度計(jì)對PpIX的濃度進(jìn)行標(biāo)定，得到PpIX的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而標(biāo)定PTGR中的PpIX含量。

圖2 (a)PTGR及(b)PTGR酶解后的質(zhì)譜

表1 PTGR的粒徑和電勢

圖3 PTGR的(a)透射式電子顯微鏡圖像，(b)臨界膠束濃度(CMC)和(c)PpIX 的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 PTGR溶液分別在避光和680 nm激光(30 mW/cm2)誘導(dǎo)條件下，DCF在525 nm處的熒光強(qiáng)度隨光照時(shí)間的變化

最后對PTGR產(chǎn)生ROS的性能進(jìn)行了探究，如圖4所示，通過熒光分光光度計(jì)檢測，發(fā)現(xiàn)在360 s內(nèi)，在680 nm激光的誘導(dǎo)下，PTGR溶液在525 nm處的熒光強(qiáng)度比初始的熒光強(qiáng)度高了20倍，而避光條件下的PTGR溶液在525 nm處的熒光強(qiáng)度變化較小。表明PTGR在特定波長的激光誘導(dǎo)下，能夠在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，從而具備殺死細(xì)胞的潛力。而在避光的情況下，產(chǎn)生的ROS較少，則對細(xì)胞的毒性較小。因而可以通過光照時(shí)間的長短和光照區(qū)域的不同，控制PTGR產(chǎn)生ROS的量和位置，從而發(fā)揮光動(dòng)力治療。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 對癌細(xì)胞靶向能力的檢測

由圖5可知，HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核周圍出現(xiàn)了大量的PpIX的紅色熒光，而COS 7細(xì)胞的細(xì)胞核周圍的紅色熒光較少。這是由于PTGR中含有靶向肽RGD，能夠識別HeLa細(xì)胞表面過度表達(dá)的整合素αvβ3，在穿膜肽R8的引導(dǎo)下，光敏劑PpIX能夠快速被運(yùn)輸?shù)紿eLa細(xì)胞內(nèi)。由于HeLa細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)的組織蛋白酶B能有效切斷GFLG序列，最終導(dǎo)致PTGR膠束瓦解并釋放出PpIX。但是，正常細(xì)胞COS 7表面表達(dá)整合素αvβ3較少，導(dǎo)致出現(xiàn)在COS 7細(xì)胞內(nèi)的PpIX較少。該實(shí)驗(yàn)證明PTGR能夠有效的被癌細(xì)胞內(nèi)吞并釋放出PpIX。

圖5 PTGR分別與HeLa細(xì)胞和COS 7細(xì)胞共同培養(yǎng)4 h的共聚焦顯微鏡圖像。比例尺：20 μm

2.2.2 對癌細(xì)胞線粒體靶向能力的檢測

如圖6所示，PpIX的紅色熒光與Mito track green的綠色熒光能夠很好的重合，這是由于PTGR材料經(jīng)過HeLa細(xì)胞內(nèi)吞后釋放PpIX，隨后在TPP的引導(dǎo)下，PpIX能有效到達(dá)HeLa細(xì)胞的線粒體周圍。這為PTGR在亞細(xì)胞器周圍發(fā)揮光動(dòng)力治療提供了可能。

圖6 PTGR靶向線粒體的能力，綠色熒光為Mito Tracker Green，紅色熒光為PpIX。比例尺：20 μm

2.2.3 對PTGR在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS性能的檢測

如圖7所示，實(shí)驗(yàn)組的HeLa細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈的DCF的綠色熒光，這是由于PTGR在680 nm波長的激光光照下產(chǎn)生大量的ROS，將不發(fā)光的DCFH氧化為發(fā)綠色熒光的DCF。而空白組和對照組培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞中幾乎沒有綠色熒光區(qū)域，表明避光條件下的PTGR在細(xì)胞內(nèi)基本沒有產(chǎn)生ROS。上述實(shí)驗(yàn)表明，PTGR可以通過光誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，而ROS具有殺死癌細(xì)胞的能力。由此證明PTGR具有光動(dòng)力治療的潛能。

圖7 PTGR分別在避光和光照(功率密度：30 mW cm-2)條件下，在HeLa細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的情況。其中，blank為空白組。比例尺：20 μm

2.2.4 對癌細(xì)胞線粒體的損壞能力的檢測

如圖8所示，在避光條件下，HeLa細(xì)胞內(nèi)的JC-1染料基本沒有綠色熒光，隨著光照時(shí)間的增加，綠色熒光越強(qiáng)，紅色熒光越弱。這是因?yàn)镻TGR釋放的PpIX富集在HeLa細(xì)胞的線粒體周圍，并通過激光誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS，有效破壞 HeLa細(xì)胞的線粒體。此外，隨著光照時(shí)間增加，PTGR對線粒體的破壞越大。以上實(shí)驗(yàn)表明PTGR能夠在光照條件下，有效破壞癌細(xì)胞的線粒體，從而實(shí)現(xiàn)光動(dòng)力治療的目的。

圖8 PTGR隨光照時(shí)間對線粒體的破壞，綠色熒光為Aggregated JC-1，紅色熒光為Monomeric JC-1。比例尺：20 μm

3 結(jié) 論

(1)本文通過合理設(shè)計(jì)多肽序列，利用多肽的固相合成法，成功合成得到含有光敏劑PpIX的兩親性嵌合肽PTGR。PTGR在水中能夠發(fā)生自組裝，得到具有核殼結(jié)構(gòu)的納米前藥膠束。

(2)膠束PTGR能主動(dòng)靶向進(jìn)入HeLa細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)有效釋放出PpIX，并富集在癌細(xì)胞線粒體周圍。

(3)膠束PTGR在特定波長光照下，產(chǎn)生大量ROS，從而有效破壞癌細(xì)胞線粒體，以實(shí)現(xiàn)光動(dòng)力治療的目的。