6 個遺傳性凝血因子Ⅹ缺陷癥家系的表型與基因型診斷

劉佳婕，邵妍妍，梁 茜，丁秋蘭

（上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院a.醫(yī)學基因組國家重點實驗室上海血液學研究所；b.檢驗科，上海 200025）

凝血因子Ⅹ（factor X,FⅩ）是一種維生素K 依賴的絲氨酸蛋白酶，在凝血共同途徑中起到關(guān)鍵的作用。在生理條件下，其既可以被內(nèi)源性凝血途徑激活，又可以被外源性凝血途徑激活，活化的凝血因子Ⅹ（FⅩa）在Ca2+及其輔因子活化凝血因子Ⅴ（FⅤa）的共同作用下，在磷脂膜表面形成凝血酶原酶復合物，激活凝血酶原成為凝血酶，凝血酶活化纖維蛋白原生成纖維蛋白凝塊[1]。

FⅩ主要由肝臟合成并分泌至外周血中，以雙鏈糖蛋白的形式存在，其相對分子質(zhì)量為59 000，在血漿中的濃度為8～10 μg/mL。肝臟合成的未成熟FⅩ為一條含448 個氨基酸的單鏈，包括40 個氨基酸的前導肽。未成熟的FⅩ蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中進行蛋白質(zhì)加工，去除前導肽后分泌至血漿，形成成熟的FⅩ蛋白。成熟的FⅩ蛋白由相對分子質(zhì)量為17 000 大小的輕鏈和45 000 的重鏈組成，輕鏈與重鏈通過二硫鍵（Cys132/Cys302）相連。FⅩ輕鏈包含1 個γ-羧基谷氨酸區(qū)（Gla 區(qū)）、2 個類表皮生長因子區(qū)（EGF 區(qū)）；FⅩ重鏈包含活化肽區(qū)和具有催化活性的絲氨酸蛋白酶區(qū)[2]。

遺傳性FⅩ缺陷癥是一種十分罕見的常染色體隱性遺傳的出血性疾病，其由FⅩ基因（F10）突變所致。F10 位于常染色體13q34,與FⅦ基因（F7）相鄰，并處于其下游。F10 純合突變患者的FⅩ缺陷癥發(fā)病率一般為1∶1 000 000[3-4]，導致遺傳性FⅩ缺陷癥的F10 突變主要為錯義突變、無義突變、剪接位點突變及移碼突變，其中78%為錯義突變[5]。另有報道提示，13 號染色體上的大片段缺失會導致FⅩ和FⅦ的聯(lián)合缺陷[6]。根據(jù)FⅩ活性（FⅩ∶C）可將FⅩ缺陷癥患者分為輕型（>6%）、中型（1%～5%）以及重型（<1%)[7]。但FⅩ缺陷癥患者的出血表現(xiàn)與FⅩ∶C 水平間無明顯相關(guān)性，輕型患者的出血表現(xiàn)為皮膚瘀斑、鼻出血、術(shù)后或者外傷后出血等癥狀；重型患者的出血則表現(xiàn)為關(guān)節(jié)出血、胃腸道出血，甚至顱內(nèi)出血等癥狀，也有患者并無明顯的出血癥狀[8]。遺傳性FⅩ缺陷癥分為4 種[9]。①Ⅰ型即交叉反應物質(zhì)陰性，F(xiàn)Ⅹ抗原（FⅩ∶Ag）和FⅩ∶C 同時下降；②Ⅱ型即交叉反應物質(zhì)陽性，F(xiàn)Ⅹ∶Ag 正常而FⅩ∶C下降；③Ⅲ型即交叉反應物質(zhì)陽性，但內(nèi)源性及外源性以及共同途徑激活的FⅩ∶C 下降程度不同；④Ⅳ型、FⅩ和FⅦ聯(lián)合缺陷癥。

凝血酶生成試驗（thrombin generation test，TGT）能夠?qū)崟r觀察到凝血酶的生成，可從整體水平評價機體的出血傾向或高凝狀態(tài)[10-11]，是一個可以全面評估機體凝血狀況的指標。TGT 中主要有4 個參數(shù)，延遲時間（lag time,LT）、峰值、達峰時間（time to peak,TTP）以及凝血酶生成潛力（endogenous thrombin potential,ETP）[12]。目前該檢測已廣泛應用于評估血友病患者的出血傾向及抑制物陽性血友病患者的療效監(jiān)測等領(lǐng)域[11]，但對于評估其他少見凝血因子缺陷癥患者的出血傾向的應用較少。本實驗室Liang 等[13]曾報道，對于FⅩ缺陷癥患者來說，在濃度為1pM（1 pmol/L）組織因子（tissue factor,TF）激活條件下，為避免接觸激活的干擾，需預先在血漿中加入接觸激活抑制劑，即玉米胰蛋白酶抑制劑（corn trypsin inhibitor,CTI），且與5pM TF 激活相比，1pM TF 激活下的TGT 具有更高的靈敏度，可以在該條件下評估FⅩ缺陷癥患者的出血風險。因此，本研究在患者血漿內(nèi)預先加入CTI，并在1pM TF 激活條件下進行TGT 的檢測以評估FⅩ缺陷癥患者的出血傾向。

本研究對6 個遺傳性FⅩ缺陷癥家系進行了臨床表型和基因型的檢測，并采用TGT 參數(shù)評估FⅩ缺陷癥患者的出血風險。

資料與方法

一、資料

收集2014 年1 月到2019 年6 月就診于上海交通大學附屬瑞金醫(yī)院血栓與止血門診，經(jīng)表型檢測及基因檢測確診為遺傳性FⅩ缺陷癥，最終本研究納入6 個遺傳性FⅩ缺陷癥家系。

二、方法

1.外周血采集：獲得6 例先證者、4 名家系成員及6 名正常對照的知情同意后,采集其外周血,分別以2 種不同方式抗凝。①將外周血加入0.109 mol/L枸櫞酸鈉（9∶1）抗凝管中抗凝；②將外周血加入含0.109 mol/L 的枸櫞酸鈉0.3 mL 及0.05 mL CTI 的抗凝管中抗凝（CTI 終濃度為18.3 μg/mL），后者僅用于TGT 的檢測。標本于室溫下行3 000×g 離心15 min,取上層1/2 乏血小板血漿（platelet-poor plasma,PPP），剩余部分再次行3 000×g 離心15 min，收集上層PPP,立即置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.凝血功能篩查：采用日本Sysmex CS5100 全自動凝血儀檢測活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原（fibrinoger，F(xiàn)g）等凝血指標。采用HemosILTM 試劑（IL 公司,美國）和ACL-TOP 全自動血凝儀（IL 公司，美國）的凝固法檢測凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的促凝活性。將先證者血漿與正?；旌涎獫{按1∶1 混合,分別檢測即刻及37 ℃溫育2 h 后的PT、APTT,檢測血漿中FⅩ抑制物是否存在。

3.內(nèi)源性凝血途徑、外源性凝血途徑及共同途徑激活FⅩ后FⅩ∶C 的檢測：FⅩ在內(nèi)源性、外源凝血途徑（PT 途徑、APTT 途徑）及共同途徑蝰蛇毒（Russell's viper venom，RVV）激活的FⅩ∶C 檢測均采用凝固法，在ST4 半自動血凝儀(法國Stogo 公司) 上進行檢測。正?；旌涎獫{用巴比妥緩沖液（pH=7.35）稀釋，以1∶10 稀釋后對應FⅩ∶C 為100%，以不同稀釋度如1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640 對應的FⅩ∶C 與所測得的對應凝固時間作標準曲線。將先證者及家系成員血漿按1∶10 稀釋后，檢測凝固時間，并根據(jù)標準曲線計算內(nèi)、外源途徑及共同途徑激活后FⅩ∶C。

4.FⅩ∶Ag 測定：利用酶聯(lián)免疫吸附試驗雙抗體夾心法檢測血漿中FⅩ∶Ag 含量。一抗為兔抗人FⅩ多克隆抗體（丹麥Dako 公司），二抗為辣根過氧化物酶標記的兔抗人FⅩ∶IgG（丹麥Dako 公司）。正常混合血漿以1∶200 稀釋對應的FⅩ∶Ag 為100%，以不同稀釋度如1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800 對應的FⅩ∶Ag 與所測得的對應吸光度值（A）作標準曲線。將先證者及家系成員血漿按1∶200 稀釋，檢測A，并根據(jù)標準曲線計算FⅩ∶Ag。

5.蛋白印跡法檢測血漿中的FⅩ：6 例先證者血漿及正常人混合血漿分別用磷酸鹽緩沖液稀釋20 倍，加非還原型上樣緩沖液，95 ℃變性5 min，上樣10 μL 進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，以鼠抗人FⅩ多克隆抗體（丹麥Dako 公司）為一抗，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG（Santa cruz 公司，美國）作二抗，用電化學發(fā)光檢測試劑放色自顯影檢測血漿中FⅩ相對分子質(zhì)量及含量變化。

6.TGT：采用自動校正凝血酶曲線法（calibratedautomated thrombogram,CAT）法檢測,試劑盒及軟件均購自荷蘭Thrombinoscope BV 公司。用Fluoroskan Ascent FL 熒光讀數(shù)儀檢測在1pM TF激活下血漿的凝血酶生成量。TGT 主要有4 個參數(shù)，LT 即從反應開始到凝血酶開始生成所經(jīng)歷的時間；峰值即生成的凝血酶的最大量；TTP 即從反應開始到凝血酶到達最大量所經(jīng)歷的時間；ETP 即凝血酶生成曲線下的微積分面積，整體反映凝血酶生成的量。

7.F10 突變檢測及外顯子拷貝數(shù)變異分析：外周血DNA 采用Qiagen 公司的DNA 抽提試劑盒進行抽提（Qiagen 公司，荷蘭）。擴增先證者F10 的8 個外顯子及其側(cè)翼序列和5′、3′端非翻譯區(qū),直接進行測序,將測序結(jié)果同基因文庫中F10 序列進行比對，尋找致病突變，并對其家系成員相應突變位點進行檢測。針對先證者新的突變位點，在千人數(shù)據(jù)庫中進行篩查，并同時篩查100 名健康獻血者的DNA，PCR 擴增并測序，排除突變位點的多態(tài)性。利用AccuCopy（上海天昊生物科技有限公司）多重熒光競爭PCR 法對先證者F10 的8 個外顯子進行拷貝數(shù)變異分析。

8.統(tǒng)計學處理：用Graphpad Prism V5.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，各組間比較采用Kruskal Wallis檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、先證者及家系成員的臨床信息及相關(guān)檢測結(jié)果

6 例先證者包括3 例男性及3 例女性，具體的臨床表現(xiàn)、出血評分及相關(guān)檢測結(jié)果詳見表1。所有先證者的PT 及APTT 均延長，F(xiàn)Ⅹ∶C 及FⅩ∶Ag均有不同程度的下降，依據(jù)FⅩ∶C 及FⅩ∶Ag 下降程度的不同，先證者1、5、6 屬于Ⅰ型FⅩ缺陷癥患者，先證者2、3、4 屬于Ⅱ型FⅩ缺陷癥患者。蛋白印跡檢測結(jié)果顯示，6 例先證者血漿中FⅩ含量較正常人混合血漿中FⅩ含量明顯減少，相對分子質(zhì)量與正常FⅩ相同（見圖1）。

二、F10 突變檢測結(jié)果

6 例先證者F10 突變檢測結(jié)果詳見表1。家系分析均符合孟德爾遺傳規(guī)律，家系圖見圖2。先證者1、3、4、5、6 均為雙雜合突變患者，突變分別來自于父母，先證者2 為單雜合突變患者。

三、TGT 各項參數(shù)檢測結(jié)果及凝血酶生成曲線

6 例FⅩ缺陷癥患者及部分家系成員TGT 各項參數(shù)檢測結(jié)果及凝血酶生成曲線如表2 和圖3。

表1 6 例先證者臨床信息、表型及基因檢測結(jié)果

圖2 6 個遺傳性FⅩ缺陷癥患者家系圖及相關(guān)突變

表2 6 例FⅩ缺陷癥患者及部分家系成員TGT 各項參數(shù)檢測結(jié)果

四、TGT 各參數(shù)在3 組臨床出血嚴重程度不同的FⅩ缺陷癥患者間的比較

根據(jù)臨床表型的不同，將先證者和其家系成員分為3 類，將關(guān)節(jié)出血、肌肉出血、消化道出血等危及生命的出血癥狀列為重型，而輕型則為傷后或者術(shù)后出血以及鼻出血、口腔出血，其余為無出血癥狀。

圖3 凝血酶生成曲線

圖4 3 組臨床出血嚴重程度不同的FⅩ缺陷癥患者間的TGT 各參數(shù)比較

在本研究中，先證者1 的父母、先證者3 的兒子，先證者5、先證者5 的父親為無出血癥狀組，先證者2、3、4 為輕型癥狀組，先證者1、先證者6 為重型癥狀組。本研究將TGT 的各項參數(shù)在3 組中進行比較發(fā)現(xiàn)（見圖4），峰值、ETP 在3 組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而LT 和TTP 在各組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。對于存在重型出血癥狀的先證者6 和先證者1 來說，其TGT 中僅檢測到非常少量的凝血酶生成，峰值分別僅有正常人的3.27%和4.08%，ETP 為正常人的8.66%和10.13%。而在輕型癥狀組中，先證者3 以及先證者4 的峰值分別為正常人的16.87%以及5.45%，ETP 分別為正常人的23.14%和10.31%，而同樣存在輕型出血癥狀的先證者2 的峰值和ETP 分別為正常人的60.34%和78.77%，與其表型不相符合，其原因有待于進一步探討。無出血癥狀組中，ETP 和峰值均為正常對照的30%以上。

討 論

遺傳性FⅩ缺陷癥是一種由于F10 突變所導致的罕見遺傳病，至今已有146 種F10 基因突變被報道[14]（見圖5）。本研究在6 個遺傳性FⅩ缺陷癥家系中共發(fā)現(xiàn)了5 名攜帶F10 雙雜合突變的先證者以及1 名攜帶F10 單雜合突變的先證者，并發(fā)現(xiàn)了10 種可導致FⅩ缺陷癥的突變，其中5 種為新突變。

一、各先證者分析

1.先證者1：先證者1 攜帶Phe71Ser 和Val338Met 2 種已報道的F10 突變。Phe71 位于FⅩ輕鏈Gla 結(jié)構(gòu)域的N 端，該位點在16 個物種中保守，Phe71Ser 會導致Ⅰ型FⅩ缺陷癥。苯丙氨酸是一種芳香族的疏水基團，絲氨酸為親水性的氨基酸，兩者理化性質(zhì)不同，苯丙氨酸被絲氨酸取代后會破壞FⅩ蛋白的疏水內(nèi)核，改變了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，導致部分Gla 結(jié)構(gòu)域錯誤折疊，從而改變了Gla結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象。攜帶純合Phe71Ser 突變的患者表現(xiàn)為重型出血，包括關(guān)節(jié)出血等[13]。Val338 位于絲氨酸蛋白酶區(qū)，并且結(jié)構(gòu)保守，蛋氨酸取代纈氨酸后對局部親水性不會有很大的影響，但是蛋氨酸具有較大側(cè)鏈，取代纈氨酸后影響了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，引發(fā)蛋白質(zhì)錯誤折疊，可能導致蛋白質(zhì)合成分泌障礙。該突變會導致Ⅰ型FⅩ缺陷癥，攜帶該純合突變的患者，表現(xiàn)為重型出血[15]。本研究中攜帶Phe71Ser 以及Val338Met 雙雜合突變的先證者1 為Ⅰ型FⅩ缺陷癥，表現(xiàn)為重型出血，如肌肉出血等。

2.先證者2：先證者2 存在單雜合F10 突變Gly406Ser。Gly406 位于底物結(jié)合位點中，與Asp413和Gly440 結(jié)合形成底物結(jié)合口袋，該突變會破壞酶促活性區(qū)的原始構(gòu)象，導致底物結(jié)合的缺陷，使FⅩ失去酶活性。攜帶純合Gly406Ser 突變的患者，表現(xiàn)為輕型出血，包括牙齦出血，月經(jīng)量過多等癥狀。有研究報道，攜帶單雜合突變的患者存在輕度鼻出血的癥狀[16-19]。先證者2 為Ⅱ型FⅩ缺陷癥患者，存在術(shù)后出血以及拔牙后出血等輕型出血癥狀，但該名攜帶單雜合突變先證者的發(fā)病機制有待于進一步研究。

圖5 F10 結(jié)構(gòu)以及發(fā)現(xiàn)的突變

3.先證者3：先證者3 攜帶Cys246Ser 以及Tyr319Cys 2 種新的F10 突變。Cys246 位于活化肽區(qū)，Cys240 和Cys246 之間形成二硫鍵，維持該區(qū)域的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，絲氨酸取代半胱氨酸，可能破壞了Cys240-Cys246 二硫鍵的形成，影響蛋白質(zhì)折疊及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運。Tyr319 位于FⅩ蛋白的絲氨酸蛋白酶區(qū)，該位點在空間位置上靠近由His276、Asp322 以及Ser379 形成的活性中心，因此Tyr319Cys 突變可能會影響蛋白質(zhì)功能。先證者3 為Ⅱ型FⅩ缺陷癥患者，存在月經(jīng)量多、外傷后出血等輕型出血表現(xiàn)。

4.先證者4：先證者4 存在Gly365Arg 和Leu252Phe 2 種F10 突變。Gly365Arg 突變已被報道，該突變導致Ⅱ型FⅩ缺陷癥[20]，Gly365 位于FⅩ因子2 個β 折疊之間，對于FⅩ蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起了很大作用，Gly365Arg 突變使得甘氨酸被精氨酸取代，破壞氨基酸殘基間的相互作用，從而導致蛋白質(zhì)部分錯誤折疊。Leu252 位于FⅩ蛋白的活化肽區(qū)，并組成了一條疏水性的β 鏈，亮氨酸被苯丙氨酸取代后，可能會破壞β 鏈的結(jié)構(gòu)，導致蛋白質(zhì)的錯誤折疊并進一步影響FⅩ蛋白的功能。先證者4為Ⅱ型FⅩ缺陷癥患者，3 條不同途徑的FⅩ∶C 均在5%左右，而FⅩ∶Ag 則為35.4%,且存在自發(fā)鼻出血、牙齦出血，皮膚易發(fā)淤斑等輕型出血癥狀。文獻報道了Gly365Arg 突變導致的1 例Ⅱ型FⅩ缺陷癥患者，而其FⅩ∶Ag 為35.4%，僅為正常值的一半，因此新突變Leu252Phe 很可能會導致Ⅰ型FⅩ缺陷癥。

5.先證者5：先證者5 攜帶Arg313Gln、IVS5-2A＞G 2 種新的F10 突變，其中Arg313 位于FⅩ蛋白的絲氨酸蛋白酶區(qū)，該位置與Arg327 鄰近，Arg327 位于與FⅤa 結(jié)合位點的區(qū)域內(nèi)，因此313位精氨酸被谷氨酰胺取代后，很可能會影響到蛋白質(zhì)構(gòu)象從而影響FⅩa 與FⅤa 的結(jié)合。IVS5-2A＞G 可能會影響到FⅩ蛋白質(zhì)剪切，產(chǎn)生不穩(wěn)定的mRNA，從而導致其在體內(nèi)降解過快。先證者5 為Ⅰ型FⅩ缺陷癥患者，無明顯的出血癥狀。

6.先證者6：先證者6 存在Phe71Ser、Cys151Arg 2 種F10 突變。Phe71Ser 也在先證者1身上發(fā)現(xiàn)，而Cys151Arg 此前也由Liang 等[13]進行了報道。Cys151 位于表皮生長因子2 結(jié)構(gòu)域，并與Cys164 間存在二硫鍵，與FⅩ蛋白的二級結(jié)構(gòu)相關(guān)。當半胱氨酸被精氨酸取代后，可破壞此二硫鍵，并嚴重影響FⅩ蛋白的正確折疊、穩(wěn)定性及分泌。在此前的報道中，Cys151Arg 被發(fā)現(xiàn)于1 例雙雜合FⅩ缺陷癥患者中，該患者為Ⅰ型FⅩ缺陷癥患者，存在顱內(nèi)出血等重型出血表現(xiàn)。先證者6 為Ⅰ型FⅩ缺陷癥患者，表現(xiàn)為重型出血，包括關(guān)節(jié)出血及肌肉血腫等癥狀。

二、TGT 的價值

FⅩ缺陷癥是一種罕見的出血性疾病，由于患者攜帶突變的不同，臨床表現(xiàn)存在異質(zhì)性，重則危害生命，輕則無出血癥狀，F(xiàn)Ⅹ∶C 不能較好地預測患者的出血狀況，而TGT 是一種可以較全面地評估機體凝血功能的檢測方法，因此本研究對這6 例先證者及其部分家系成員進行TGT 的檢測，來研究TGT 可否作為預測FⅩ缺陷癥患者出血情況的有效檢測手段。分析患者的臨床表現(xiàn)及TGT 結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在FⅩ缺陷癥患者中LT、TTP 均存在不同程度的延長，其中先證者4 延長程度最甚，但LT 及TTP 在無出血癥狀患者、重型出血表現(xiàn)患者和輕型出血表現(xiàn)患者間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。6 例FⅩ缺陷癥患者的ETP 和峰值均明顯降低，表明在FⅩ缺陷癥患者中凝血酶生成量存在不同程度的減少，并且在無出血癥狀患者、重型出血表現(xiàn)患者和輕型出血表現(xiàn)患者間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），因此，在FⅩ缺陷癥患者中，TGT 的ETP 及峰值可以預測、評估患者的出血狀況。但存在輕型出血癥狀的先證者2 的ETP 和峰值分別占到了正常對照的78.77%和60.34%，與其臨床出血表現(xiàn)不符，這可能是由于該患者機體內(nèi)的凝血狀況受到了除FⅩ因子以外其他因素的影響，具體的原因有待于進一步研究。

總之，F(xiàn)Ⅹ缺陷癥是一種非常少見的遺傳性出血性疾病，本研究在6 個FⅩ缺陷癥家系中發(fā)現(xiàn)了10 種F10 突變，其中包括5 種新突變，并且探討了6 例FⅩ缺陷癥患者可能的分子發(fā)病機制，另外，在本研究中發(fā)現(xiàn)1pM TF 激活下的TGT 中測得的ETP 及峰值與FⅩ缺陷癥患者的臨床表現(xiàn)間具有相關(guān)性，因此TGT 中的ETP、峰值結(jié)合常規(guī)凝血指標及FⅩ∶C 可以作為評估FⅩ缺陷癥患者出血傾向的有效手段，對臨床預防和治療起一定的作用。