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    WISP-3/CNN6與Caspase-8共結(jié)合在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制

    2020-04-27 08:49黃曉梅王康瑋唐萬(wàn)娜趙祝香趙子文魏樹(shù)全
    新醫(yī)學(xué) 2020年4期
    關(guān)鍵詞:活化誘導(dǎo)抗體

    黃曉梅 王康瑋 唐萬(wàn)娜 趙祝香 趙子文 魏樹(shù)全

    【摘要】目的 探討Wnt-1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白3/調(diào)節(jié)蛋白6(WISP-3/CNN6)與半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)共結(jié)合在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡中的作用與可能機(jī)制。方法 利用小干擾RNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)對(duì)人肺上皮Beas-2B細(xì)胞中WISP-3/CCN6基因的沉默或過(guò)表達(dá),分別將低表達(dá)或過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6的Beas-2B細(xì)胞置高氧(95%O2和5%CO2)或空氣中處理0、24、48 h,通過(guò)蛋白免疫印跡法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase途徑凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8、Caspase-3及活性片段cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和cleaved 多聚ADP核糖聚合酶(PARP)的表達(dá)量及Caspase-8活性,通過(guò)免疫共聚焦和免疫共沉淀檢測(cè)WISP-3/CCN6與Caspase-8的蛋白相互作用。結(jié)果 高氧刺激48 h,WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白表達(dá)量均比0 h時(shí)增加(P均< 0.017),且Caspase-8的活性增高(P < 0.05);過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)量比0 h時(shí)減少(P < 0.017),cleaved Caspase-3和cleaved PARP的蛋白表達(dá)量在24 h時(shí)比0 h時(shí)升高、在48 h時(shí)比24 h時(shí)下降(P均< 0.017)。高氧刺激下,Beas-2B細(xì)胞中WISP-3/CCN6蛋白和Caspase-8蛋白結(jié)合減少。結(jié)論 WISP-3/CCN6通過(guò)Caspase途徑參與高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控,其作用可能通過(guò)與Caspase-8蛋白結(jié)合方式實(shí)現(xiàn)。

    【關(guān)鍵詞】高氧;細(xì)胞凋亡;Wnt-1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白3/調(diào)節(jié)蛋白6;半胱氨酸蛋白酶途徑;急性肺損傷

    【Abstract】Objective To investigate the role and the molecular mechanism of WISP-3/CCN6 binding with Caspase-8 in the hyperoxia-induced apoptosis of the lung epithelial cells. Methods The silencing and overexpression of WISP-3/CCN6 in the human lung bronchial epithelial cells (Beas-2B) were performed by plasmid transfection and siRNA. The Beas-2B cells with silencing or overexpressing WISP-3/CCN6 were maintained in hyperoxia (95%O2 and 5%CO2) or air for 0, 24 and 48 h, respectively. The expression levels of key proteins of Caspase signaling pathway (Caspase-8, Caspase-3, cleaved Caspase-8, cleaved Caspase-3 and PARP) were detected with Western blot and the activity of Caspase-8 was determined with flow cytometry. The protein interaction between WISP-3/CCN6 and Caspase-8 was analyzed by immunoconfocal and immunocoprecipitation. Results After 48-h hyperoxia treatment, the expression levels of cleaved Caspase-8, cleaved Caspase-3 and cleaved PARP in the Beas-2B cells with silencing WISP-3/CCN6 were significantly up-regulated (all P < 0.017) and the activity of Caspase-8 was remarkably increased compared with those at 0 h (P < 0.05). The expression of cleaved Caspase-8 in the Beas-2B cells with overexpressing WISP-3/CCN6 was significantly down-regulated than that at 0 h (P < 0.017). The expression levels of cleaved Caspase-3 and cleaved PARP at 24 h were significantly up-regulated than those at 0 h, whereas the expression levels at 48 h were significantly down-regulated compared with those at 24 h (all P < 0.017). The protein interaction between WISP-3/CCN6 and Caspase-8 was signigficantly decreased in the Beas-2B cells after hyperoxia. Conclusion WISP-3/CCN6 participates in the regulation of hyperoxia-induced apoptosis of lung epithelial cells via the Caspase signaling pathway, probably by binding with Caspase-8 protein.

    【Key words】Hyperoxia;Cell apoptosis;WISP-3/CCN6;Caspase pathway;Acute lung injury

    高濃度氧療對(duì)危重癥患者的危害已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外呼吸危重癥領(lǐng)域的關(guān)注,但國(guó)內(nèi)相關(guān)研究仍然較少。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)高氧可以引起肺上皮細(xì)胞凋亡[1]。有研究顯示,Wnt-1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白3/調(diào)節(jié)蛋白6(WISP-3/CCN6)作為一種信號(hào)傳導(dǎo)因子在高氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡中具有保護(hù)性作用,但其機(jī)制仍然不清楚。本文將在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究WISP-3/CCN6在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制,為未來(lái)防治高氧性肺損傷提供基礎(chǔ)依據(jù)。

    材料與方法

    一、細(xì)胞培養(yǎng)

    人肺上皮細(xì)胞株(Beas-2B細(xì)胞)購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)。細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于37℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

    二、高氧模型的建立

    參考本課題組前期研究建立高氧模型[2-3]。

    三、WISP-3/CCN6質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染

    通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和小干擾RNA(siRNA)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)Beas-2B細(xì)胞中WISP-3/CCN6基因的過(guò)表達(dá)及沉默,選用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒,購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,詳細(xì)步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

    四、蛋白免疫印跡檢測(cè)

    分別把沉默或過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6基因的Beas-2B細(xì)胞置于高氧中培養(yǎng)0、24、48 h,以空氣環(huán)境為對(duì)照(control)。提取各組細(xì)胞蛋白,蛋白免疫印跡法檢測(cè)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)途徑凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8、Caspase-3和活化片段cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3以及cleaved-多聚ADP核糖聚合酶(PARP)表達(dá)量。WISP-3/CCN6、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。采用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

    五、流式細(xì)胞儀檢測(cè)Caspase-8蛋白活性

    采用美國(guó)BD公司的Caspase-8蛋白活性檢測(cè)試劑盒和BD公司的流式細(xì)胞儀檢測(cè)空氣環(huán)境及高氧刺激0、48 h時(shí)WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中Caspase-8的活性。

    六、免疫熒光-激光共聚焦試驗(yàn)

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證WISP-3/CCN6在高氧刺激肺上皮細(xì)胞的作用方式,利用免疫熒光-激光共聚焦和免疫共沉淀法檢測(cè)WISP-3/CCN6蛋白與細(xì)胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白的結(jié)合變化。其中免疫熒光-激光共聚焦采用美國(guó)Sigma公司的抗WISP-3/CCN6抗體、美國(guó)Santa Cruz公司的抗Caspase-8抗體和德國(guó)Leica公司的激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。步驟為:①24孔板中放置圓形玻片,將Beas-2B細(xì)胞接種于玻片上;②放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到細(xì)胞密度約50% ~ 60%,把細(xì)胞分別置于高氧(95%O2和5%CO2)和空氣中處理24 h;

    ③用鑷子輕輕取出玻片置于操作臺(tái)上,趁玻片未干時(shí)向玻片滴入磷酸鹽緩沖液(PBS),然后負(fù)壓吸干,洗滌3次;④在玻璃片上滴入4%多聚甲醛,固定30 min后,負(fù)壓吸干,固定細(xì)胞;⑤滴入0.5% Triton-X-100覆蓋整個(gè)玻片,室溫放置1 h(細(xì)胞膜打孔);⑥然后用PBS洗滌3次,滴入5%牛血清白蛋白,室溫放置2 h;⑦把玻片放回24孔板,加入1∶100的一抗(Caspase-8抗體和WISP-3/CCN6抗體)4 ℃過(guò)夜孵育;⑧次日取出,用PBS洗滌3次后加入熒光抗體(紅色為Caspase-8抗體,綠色為WISP-3/CCN6抗體),避光孵育10 min;⑨取出玻片,自然晾干后倒扣于載玻片上,周?chē)弥讣子头膺叀W詈笤诩す夤簿劢癸@微鏡下觀察空氣環(huán)境和高氧環(huán)境下Caspase-8與WISP-3/CCN6的結(jié)合情況。

    七、免疫共沉淀試驗(yàn)

    采用美國(guó)Abcam公司的細(xì)胞裂解液RIPA緩沖液、美國(guó)Sigma公司的抗WISP-3/CCN6抗體進(jìn)行檢測(cè)。步驟為:①把Beas-2B細(xì)胞接種于6孔板,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到細(xì)胞密度約50% ~ 60%,把細(xì)胞分別置于高氧(95%O2和5%CO2)、空氣中處理4 h;②取出細(xì)胞置于冰上,用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞2次后,加入細(xì)胞裂解液RIPA buffer(含蛋白酶抑制劑),冰上裂解30 min;③4℃,18 000轉(zhuǎn)/分離心30 min后,把上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管,取少量樣品以備蛋白免疫印跡分析;④在樣品中加入1 μl的興趣蛋白抗體,4℃搖床緩慢搖晃孵育過(guò)夜;⑤次日取10 μl的Protein A 瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3 次,每次3000轉(zhuǎn)/分離心3 min;⑥將預(yù)處理過(guò)的10 μl

    的Protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的樣品中,4℃搖床緩慢搖晃孵育2 ~ 4 h,使抗體與protein A瓊脂糖珠充分偶聯(lián);⑦4℃,3000轉(zhuǎn)/分

    離心3 min,將瓊脂糖珠離心至管底,將上清小心吸去,瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗滌3 ~ 4次,洗滌時(shí)用手指輕彈;⑧最后加入15 μl的2倍SDS 上樣緩沖液,沸水煮5 min,免疫印跡檢測(cè)目的蛋白。本研究的興趣蛋白為WISP-3/CCN6,目的蛋白為Caspase-8。

    八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 22.0分析結(jié)果,計(jì)量資料采用表示,組間比較采用方差分析,P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩兩比較采用Bonferroni法,即P < 0.05/3 = 0.017為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié)果

    一、環(huán)境對(duì)WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中Caspase途徑凋亡相關(guān)蛋白的影響

    無(wú)論是高氧刺激還是空氣環(huán)境下,WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯變化(P均> 0.05)??諝猸h(huán)境下,WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量均無(wú)變化(P均> 0.05)。高氧刺激下,WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)量在24 h和48 h升高(總體比較F = 13.590、P = 0.006,與0 h比較P均< 0.017),cleaved Caspase-3僅在48 h表達(dá)上調(diào)(總體比較F = 86.24、 P < 0.001,與0 h和24 h比較P均< 0.017)。WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中cleaved PARP表達(dá)量在高氧刺激(F = 728.90,P < 0.001)及空氣環(huán)境(F = 39.19,P < 0.001)24 h和48 h均升高(與0 h比較,P均< 0.017),高氧刺激下cleaved PARP表達(dá)量在WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中升高趨勢(shì)較空氣環(huán)境更明顯(與24 h比較,P < 0.017),見(jiàn)圖1A ~ C。高氧刺激48 h下,WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中的Caspase-8活性比0 h時(shí)升高,見(jiàn)圖1D。

    二、環(huán)境對(duì)WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞中Caspase途徑凋亡相關(guān)蛋白的影響

    無(wú)論是高氧刺激還是空氣環(huán)境下,WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯變化(P均> 0.05)??諝猸h(huán)境下,WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量在48 h時(shí)升高(總體比較F = 202.55、 P < 0.001,與0 h和24 h比較P均< 0.017,cleaved PARP蛋白表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高(總體比較F = 155.53、P < 0.001,3個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較P均<0.017)。高氧刺激下,WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8隨時(shí)間延長(zhǎng)而均減少(總體比較F = 21.79、P = 0.002,3個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較P均< 0.017),cleaved Caspase-3 (F = 105.10,P < 0.001)和cleaved PARP(F = 320.00,P < 0.001)蛋白表達(dá)量在24 h比0 h升高,48 h時(shí)均下降(3個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較P均< 0.017),見(jiàn)圖2。

    三、環(huán)境對(duì)肺上皮細(xì)胞中WISP-3/CCN6和Caspase-8蛋白的相互作用影響

    與空氣環(huán)境相比,高氧刺激24 h時(shí)Beas-2B細(xì)胞WISP-3/CCN6與細(xì)胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-8結(jié)合的熒光信號(hào)減少(圖3A)。把WISP-3/CCN6作為感興趣蛋白,與空氣環(huán)境相比,高氧刺激24 h時(shí)與其結(jié)合的Caspase-8蛋白減少(P < 0.001,圖3B)。

    討論

    高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制是異常復(fù)雜的,其確切的機(jī)制仍然不清楚。在凋亡通路中,Caspase家族發(fā)揮重要的作用。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡效應(yīng)因子,控制下游的凋亡共同通路,它的活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆的階段,因此Caspase-3及其活性片段也被稱(chēng)為凋亡的生物標(biāo)志物[4]。

    本研究中,肺上皮細(xì)胞中WISP-3/CCN6沉默后再接受高氧刺激48 h,細(xì)胞的cleaved Caspase-3活性片段表達(dá)增加,表明沉默WISP-3/CCN6可以促進(jìn)Caspase-3的激活。Caspase-3是凋亡外源性和內(nèi)源性途徑的共同效應(yīng)蛋白,它的激活可以進(jìn)一步活化下游的凋亡因子,如PARP[5-7]。多種凋亡刺激因子可以啟動(dòng)Caspase-3活化,Caspase-3蛋白酶原被切割成有活性的片段cleaved Caspase-3,活化的Caspase-3又進(jìn)一步作用于下游的不同底物,導(dǎo)致蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終引起細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步驗(yàn)證WISP-3/CCN6與Caspase-3的關(guān)系,本研究在Beas-2B細(xì)胞中過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6,與

    0 h時(shí)相比,過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6的細(xì)胞在高氧刺激下,Caspase-3蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化,cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)量先升高,后下降。因此,WISP-3/CCN6可能控制著Caspase-3的活化,進(jìn)而調(diào)控高氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡。

    要驗(yàn)證WISP-3/CCN6通過(guò)Caspase-3調(diào)控細(xì)胞凋亡,仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證WISP-3/CCN6與其下游凋亡效應(yīng)因子的關(guān)系。本研究中Beas-2B細(xì)胞沉默和過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6基因后再接受高氧刺激48 h,結(jié)果顯示沉默WISP-3/CCN6的肺上皮細(xì)胞中 cleaved PARP蛋白表達(dá)量增加,而WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的肺上皮細(xì)胞中的cleaved PARP蛋白表達(dá)量先升高,后隨時(shí)間延長(zhǎng)下降,也就是說(shuō),WISP-3/CCN6可能影響著PARP的活化。WISP-3/CCN6對(duì)肺上皮細(xì)胞中Caspase-3和PARP活化的影響是同向的。那么在Caspase-3上游,凋亡啟動(dòng)蛋白是否也與WISP-3/CCN6有聯(lián)系呢?

    Caspase-3和Caspase-8同屬于Caspase家族,在細(xì)胞凋亡的外源性途徑中,Caspase-8是關(guān)鍵的啟動(dòng)型蛋白,Caspase-8通過(guò)誘導(dǎo)接近模式活化后可以作用于底物Caspase-3引起下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起凋亡。在正常情況下,Caspase-8存在于胞漿中,當(dāng)細(xì)胞接受死亡刺激之后,Caspase-8可以與FADD結(jié)合,從而與細(xì)胞膜上的死亡受體發(fā)生間接結(jié)合,形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合體,從而把死亡信號(hào)從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)化到細(xì)胞漿中去[8-9]。本研究在Beas-2B細(xì)胞中沉默和過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6后再接受高氧刺激24、48 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與0 h時(shí)相比,沉默WISP-3/CCN6的肺上皮細(xì)胞中cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)量增加,而WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的肺上皮細(xì)胞中的cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)量降低,也就是說(shuō),WISP-3/CCN6也可能影響著Caspase-8的活化。進(jìn)一步研究顯示,沉默WISP-3/CCN6的肺上皮細(xì)胞在高氧刺激48 h時(shí)Caspase-8的活性增強(qiáng),證實(shí)WISP-5/CCN6與Caspase-8活化有關(guān)。

    在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞模型當(dāng)中,WISP-3/CCN6與凋亡效應(yīng)蛋白Caspase-3以及其上游的凋亡啟動(dòng)蛋白Caspase-8和下游的凋亡效應(yīng)蛋白PARP均有聯(lián)系。由此推測(cè),WISP-3/CCN6可能通過(guò)Caspase通路參與了高氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡。那么WISP-3/CCN6的作用靶點(diǎn)在哪里?根據(jù)Caspase凋亡通路的原理,推測(cè)其作用靶點(diǎn)在Caspase-8或其上游。為此,本研究通過(guò)蛋白的相互作用了解WISP-3/CCN6與Caspase-8的關(guān)系。目前檢測(cè)蛋白間的相互作用常用的方法是免疫共聚焦和免疫共沉淀。該研究采用的細(xì)胞仍然是Beas-2B細(xì)胞。高氧處理24 h后,經(jīng)細(xì)胞打孔和免疫熒光染色,并通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示,與空氣環(huán)境相比,高氧刺激24 h后,WISP-3/CCN6和Caspase-8的蛋白結(jié)合熒光信號(hào)減少。同時(shí),我們把WISP-3/CCN6設(shè)為興趣蛋白,用免疫共沉淀的方法把WISP-3/CCN6及其相結(jié)合的蛋白沉淀,進(jìn)一步用蛋白免疫印跡法檢測(cè)WISP-3/CCN6與Caspase-8的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空氣環(huán)境相比,高氧刺激使WISP-3/CCN6和Caspase-8的蛋白結(jié)合減少。這兩項(xiàng)試驗(yàn)的結(jié)果表明,高氧環(huán)境中,肺上皮細(xì)胞中的WISP-3/CCN6蛋白可能通過(guò)某種機(jī)制大量丟失,其丟失導(dǎo)致WISP-3/CCN6與Caspase-8的蛋白結(jié)合減少,進(jìn)而導(dǎo)致Caspase-8激活,Caspase-8的活化引起其下游的一系列凋亡因子級(jí)聯(lián)激活,啟動(dòng)經(jīng)典的Caspase凋亡途徑,使肺上皮細(xì)胞大量凋亡。

    綜上所述,WISP-3/CCN6可能是高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要調(diào)控蛋白,也可能是防治高氧性肺損傷的一個(gè)潛在的作用靶點(diǎn),值得進(jìn)一步研究。然而高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制是異常復(fù)雜的,WISP-3/CCN6僅為其中的一個(gè)關(guān)鍵蛋白,是否存在其他的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

    參 考 文 獻(xiàn)

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    (收稿日期:2019-12-19)

    (本文編輯:林燕薇)

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