PTTG1在D-GalN/TNF-α所致LO2肝細胞損傷中的變化及對細胞凋亡的影響

沙菲菲　田軒　周浩雄　王家玉　郭云蔚

【摘要】目的 探討垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1（PTTG1）在D-半乳糖胺（D-GalN）/TNF-α所致LO2肝細胞損傷中的變化，以及對細胞凋亡的影響和機制。方法 通過蛋白免疫印跡法和免疫組織化學(xué)檢測D-GalN/TNF-α作用前后LO2肝細胞中PTTG1的表達情況，使用PTTG1 shRNA慢病毒建立PTTG1干擾的LO2肝細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株，并通過蛋白免疫印跡法和RT-PCR檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)基因糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP 78）、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的表達。結(jié)果 D-GalN/TNF-α作用于LO2肝細胞0.5 h后PTTG1蛋白表達開始逐漸增加，1 h至24 h后PTTG1蛋白表達均高于未處理組（P均< 0.05）;與未處理組相比，D-GalN/TNF-α作用6 h后的LO2肝細胞免疫組織化學(xué)PTTG1陽性細胞數(shù)增加（P均< 0.05）。與陰性對照組相比，PTTG1穩(wěn)定干擾的 LO2肝細胞中的cleaved Caspase-3及GRP 78、CHOP表達增加（P < 0.05）。結(jié)論 PTTG1在D-GalN/TNF-α所致的LO2肝細胞損傷中表達增加，且干擾PTTG1的表達可促進LO2肝細胞凋亡并激活GRP 78/CHOP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。

【關(guān)鍵詞】垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1;肝細胞損傷;凋亡;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

【Abstract】Objective To investigate the variation of pituitary tumor transforming gene 1 （PTTG1） expression in D-GalN/TNF-α-induced LO2 cell injury， evaluate the effect on cell apoptosis and unravel its underlying mechanism. Methods The expression levels of PTTG1 in the LO2 cells before and after D-GalN/TNF-αtreatment were detected by western blot and immunohistochemical staining. PTTG1-interfered LO2 cells were established by stably transfected with shRNA lentivirus targeting PTTG1 gene. The expression levels of apoptosis-related protein cleaved Caspase-3 and endoplasmic-reticulum-stress-related genes GRP 78 and CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein （CHOP） were determined by Western blot and RT-PCR. Results The expression of PTTG1 protein in the LO2 cells was gradually up-regulated at 0.5 h after treated with D-GalN/TNF-α， which was significantly higher than that in the untreated group at 1-24 h after treatment （all P < 0.05）. Compared with the value in the untreated group， the quantity of D-GalN/TNF-α-treated LO2 cells with positive PTTG1 was significantly increased （P < 0.05）. The expression levels of cleaved Caspase-3， GRP 78 and CHOP in the PTTG1-interfered LO2 cells were significantly higher compared with those in the negative controls （all P < 0.05）. Conclusions PTTG1 expression is up-regulated in D-GalN/TNF-α-induced LO2 cell injury. Interfering PTTG1 expression can promote the LO2 cell apoptosis and activate the GRP 78/CHOP endoplasmic reticulum stress signaling pathway.

【Key words】Pituitary tumor transforming gene 1;Liver cell injury;Apoptosis;

Endoplasmic reticulum stress

肝細胞損傷由多種因素如病毒感染、缺血缺氧、肝毒性物質(zhì)作用等引起，長期肝損傷導(dǎo)致疾病向肝纖維化、肝硬化甚至肝癌發(fā)展。肝細胞凋亡對于清除外來刺激、維持穩(wěn)態(tài)和肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展都起著重要作用，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是導(dǎo)致肝細胞凋亡的重要機制之一[1]。垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1（PTTG1）是于1997年在大鼠垂體腫瘤中首次被發(fā)現(xiàn)的癌基因，在正常人體大部分組織中低表達，而在許多腫瘤組織中表達顯著升高，如垂體瘤、甲狀腺癌、肝癌等[2-4]。PTTG1在細胞增殖、凋亡、DNA損傷修復(fù)等過程中起重要作用，其中，研究發(fā)現(xiàn)PTTG1對細胞凋亡的影響在不同的組織、細胞中既有誘導(dǎo)亦有抑制[5-7]。D-半乳糖胺（D-GalN）可通過增加肝細胞對肝毒性物質(zhì)的敏感性增強TNF-α的促凋亡作用[8]。本研究通過觀察PTTG1在D-GalN/TNF-α誘導(dǎo)的LO2人正常肝細胞損傷過程中的變化、干擾LO2肝細胞中PTTG1的表達并觀察其與細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系，探討PTTG1在LO2肝細胞損傷過程中的作用機制。

材料與方法

一、材 料

LO2人正常肝細胞系由中國科學(xué)院干細胞庫提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶和嘌呤霉素均購自美國Gibco公司;D-GalN購自Sigma公司;TNF-α購自R&D公司;RNA快速提取試劑盒購自奕杉生物;ReverTra? Ace cDNA合成試劑盒購自TOYOBO公司;qRT-PCR SYBR Green Kit購自南京諾唯贊生物科技公司。β-actin單克隆抗體購自Sigma公司，PTTG1單克隆抗體購自Abcam公司，GRP 78 抗體購自ABclonal公司 ，CHOP、cleaved Caspase-3及WB二抗購自Cell Signaling Technology公司。免疫組織化學(xué)（免疫組化）二抗購于碧云天生物技術(shù)公司。PTTG1 shRNA慢病毒及陰性對照病毒由上海吉凱基因公司構(gòu)建。

二、方 法

1. 細胞培養(yǎng)與處理

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)LO2肝細胞，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞處于對數(shù)生長期時，0.25%胰酶消化后傳代、鋪板。在探究LO2肝細胞中PTTG1在D-GalN/TNF-α作用下的變化情況實驗中，各處理組分別加入D-GalN （100 mg/ml）/TNF-α（40 ng/ml）處理0.5、1、6、12、24 h，設(shè)立不作處理的空白對照組。在細胞免疫組化染色實驗中，處理組加入D-GalN（100 mg/ml）/TNF-α（40 ng/ml）作用6 h，空白對照組不做處理為未處理組。

2. 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達

向各組細胞中加入適量含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，冰上裂解30 min后用細胞刮收集細胞，用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加入對應(yīng)一抗后4℃孵育過夜，TBST沖洗，加入對應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST沖洗，ECL發(fā)光顯像。

3. 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測mRNA表達

根據(jù)RNA快速提取試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度與濃度，逆轉(zhuǎn)錄后測定目的基因的引物序列見表1。

4. 細胞免疫組化染色

細胞爬片，處理組加入D-GalN/TNF-α刺激6 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗，4%多聚甲醛固定20 min，PBS浸洗，0.5%Triton X-100室溫孵育15 min，PBS浸洗，3%H2O2孵育10 min，BSA封閉0.5 h，加入PTTG1單克隆抗體4℃濕盒孵育過夜，PBS浸洗，加入對應(yīng)二抗室溫孵育2 h，PBS浸洗后DAB顯色，蘇木素染核。封片后于顯微鏡下放大200倍觀察，取隨機3個視野拍照、計數(shù)PTTG1免疫組化染色陽性細胞數(shù)并分析。

5. LO2肝細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建

根據(jù)shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染說明書將3種PTTG1 shRNA慢病毒及陰性對照病毒轉(zhuǎn)染LO2肝細胞，低倍鏡下觀察到GFP熒光表達后，加入嘌呤霉素1 μg/ml進行抗性篩選。擴增細胞并取部分細胞通過蛋白免疫印跡法和RT-PCR測定PTTG1的干擾效果，挑選出最優(yōu)干擾PTTG1 shRNA慢病毒做下一步實驗，轉(zhuǎn)染陰性對照病毒做陰性對照組。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

RT-PCR結(jié)果用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。采用Graph Padprism 8.0、SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)分析并作圖。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以表示，2組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗;多組間比較采用方差分析，多重比較采用Dunnett-t檢驗或Dunnetts t3檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、D-GalN/TNF-α促進LO2肝細胞的PTTG1表達

蛋白免疫印跡法灰度分析結(jié)果顯示，未處理組PTTG1/β-actin為0.48±0.11，D-GalN/TNF-α處理0.5、1、6、12、24 h后PTTG1/β-actin值依次

為0.59±0.15、0.83±0.14、0.85±0.084、0.89 ±0.10、0.88±0.10，1 h后各處理組PTTG1蛋白表達均高于未處理組（F = 6.805，P < 0.05;0.5h處理組與未處理組比較P > 0.05，1、6、12、24 h處理組與未處理組比較P均< 0.05）（圖1A）。D-GalN/TNF-α作用于LO2肝細胞6 h，免疫組化染色PTTG1陽性率增加（t = -3.987，P < 0.05） （圖1B）。

二、PTTG1 shRNA慢病毒干擾的LO2肝細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建

3種PTTG1 shRNA慢病毒及陰性對照均成功感染LO2肝細胞，低倍鏡下可觀察到共表達的GFP熒光信號（圖2A）。RT-PCR和蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，PTTG1 shRNA-2的干擾效果最好

（F RT-PCR =245.908，F(xiàn)WB = 12.882，3種慢病毒感染組與陰性對照組比較P均< 0.05），可有效地沉默PTTG1基因（圖2B、C）。后續(xù)實驗將使用PTTG1 shRNA-2干擾后經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選穩(wěn)定的LO2肝細胞進行。

三、PTTG1基因沉默對LO2肝細胞凋亡的影響

蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，PTTG1穩(wěn)定干擾的LO2肝細胞中cleaved Caspase-3表達增加，灰度分析顯示蛋白相對表達量cleaved Caspase-3/β-actin值PTTG1干擾組為0.31±0.04，高于陰性對照組的0.21±0.02 （t = -4.484，P < 0.05）（圖3）。

四、PTTG1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的影響

RT-PCR和蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，與陰性對照相比，PTTG1穩(wěn)定干擾的LO2肝細胞中GRP 78及CHOP的mRNA和蛋白表達均增加。RT-PCR結(jié)果顯示PTTG1干擾組GRP 78及CHOP的mRNA相對表達量分別為1.80±0.38、1.80±0.23，均高于陰性對照組的1.00±0.14、1.00±0.21（tGRP 78 = -4.421，tCHOP = -5.401，P均 < 0.05）（圖4A）;蛋

白免疫印跡法灰度分析結(jié)果顯示PTTG1干擾組GRP 78/β-actin及CHOP/β-actin值分別為0.92±0.03、0.42±0.59，均高于陰性對照組的0.56±0.04、0.18 ±0.04（tGRP 78/β-actin = -11.418，tCHOP/β-actin = -6.043，P均 < 0.05）（圖4B）。

討論

PTTG1是1997年首次被發(fā)現(xiàn)的癌基因，并被證實其為有絲分裂過程中介導(dǎo)姐妹染色單體分離的關(guān)鍵蛋白“分離酶抑制蛋白（securin）”[2， 9]。其主要位于胞漿中，小部分位于細胞核，在細胞增殖、DNA的損傷和修復(fù)、代謝、血管生成等生理過程中起重要作用[9-12]。PTTG1參與多種肝臟疾病發(fā)生發(fā)展。如HBV、HCV感染能促進PTTG1的表達和轉(zhuǎn)錄激活作用，其中PTTG1還可正向調(diào)控HBV，增強其表達和復(fù)制[13-16]。大量生物信息學(xué)分析表明，PTTG1在肝癌組織和正常組織中有顯著的差異表達，在信號通路富集分析中發(fā)現(xiàn)，肝癌中上調(diào)的差異表達基因主要富集的信號通路與代謝、細胞周期和生物氧化相關(guān)[17]。本研究證實PTTG1亦參與了D-GalN/TNF-α所導(dǎo)致的LO2肝細胞損傷的過程。

在各種因素導(dǎo)致的肝損傷性病變中，往往伴隨著肝細胞凋亡的發(fā)生。凋亡又稱程序性死亡，是細胞保持自我穩(wěn)態(tài)的一種機制，對于維持自身的更新、清除外來刺激和受損細胞起著重要作用[18]。肝細胞凋亡過強或凋亡不足都會導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)失衡，進而導(dǎo)致各種急性、慢性肝臟疾病的發(fā)生。肝細胞凋亡主要涉及3個途徑：外在途徑、內(nèi)在途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）[1， 18-19]。ERS過程中激活未折疊蛋白反應(yīng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯誤折疊的蛋白通過結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP 78，促使其從3種跨膜受體蛋白PERK、IRE1、ATF6上解離，激活后者觸發(fā)的信號級聯(lián)反應(yīng)。在此過程中，前凋亡基因CHOP的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，而CHOP的過度表達可導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生[20]。

PTTG1對細胞凋亡的影響，目前的研究表明其在不同的組織、細胞中作用不盡相同。干擾SH-J1肝癌細胞中PTTG1的表達后，細胞凋亡增加，并激活了p53[5]。同樣，干擾HepG2、SMCC-7721肝癌細胞系中PTTG1的表達亦促進了細胞凋亡[21]。相反，在MCF-7乳腺癌細胞、HEK293細胞和p53突變型的PC-3人前列腺癌細胞中的研究發(fā)現(xiàn)，PTTG1的過表達通過p53依賴途徑促進了細胞凋亡[7]。PTTG1對于細胞凋亡的影響是否存在組織或細胞特異性目前尚無定論，但研究至少表明PTTG1部分通過p53介導(dǎo)的信號通路對細胞凋亡產(chǎn)生影響，同時還報道了PTTG1可通過p53非依賴途徑調(diào)控細胞凋亡[7]。而本研究顯示，干擾PTTG1在LO2肝細胞中的表達，細胞凋亡增加，且上調(diào)了ERS通路GRP78/CHOP。我們推測，PTTG1基因在調(diào)控正常肝細胞急性損傷引發(fā)的細胞凋亡過程中可能起到防止細胞凋亡過度的作用。

綜上所述，PTTG1參與了D-GalN/TNF-α所致的LO2肝細胞損傷過程且表達增加，其作用與ERS通路GRP 78/CHOP所致的細胞凋亡相關(guān)。PTTG1對細胞凋亡的影響是否在肝細胞中特異性地表現(xiàn)為抑制作用，及其生理和病理調(diào)控機制，本研究目前只在LO2人正常肝細胞上進行了初步探討，后續(xù)將在其他正常肝細胞系和肝癌細胞系以及體內(nèi)進行驗證。本研究結(jié)果對進一步闡明PTTG1在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制具有重要意義。

參 考 文 獻

[1] Cao L， Quan XB， Zeng WJ， Yang XO， Wang MJ. Mechanism of Hepatocyte Apoptosis. J Cell Death， 2016， 9： 19-29.

[2] Pei L， Melmed S. Isolation and characterization of a pituitary tumor-transforming gene（PTTG）. Mol Endocrinol， 1997， 11（4）：433-41.

[3] Pei L. Genomic organization and identification of an enhancer element containing binding sites for multiple proteins in rat pituitary tumor-transforming gene. J Biol Chem， 1998，? 273（9）：5219-5225.

[4] Zhang X， Horwitz GA， Prezant TR， Valentini A， Nakashima M， Bronstein MD， Melmed S. Structure， expression， and function of human pituitary tumor-transforming gene（PTTG）. Mol Endocrinol， 1999， 13（1）：156-166.

[5] Cho-Rok J， Yoo J， Jang YJ， Kim S， Chu IS， Yeom YI， Choi JY， Im DS. Adenovirus-mediated transfer of siRNA against PTTG1 inhibits liver cancer cell growth in vitro and in vivo. Hepatology， 2006， 43（5）：1042-1052.

[6] Lai Y， Xin D， Bai J， Mao Z， Na Y. The important anti-apoptotic role and its regulation mechanism of PTTG1 in UV-induced apoptosis. J Biochem Mol Biol， 2007， 40（6）：966-972.

[7] Yu R， Heaney AP， Lu W， Chen J， Melmed S. Pituitary tumor transforming gene causes aneuploidy and p53-dependent and p53-independent apoptosis. J Biol Chem， 2000， 275（47）：36502-36505.

[8] Nagaki M， Sugiyama A， Osawa Y， Naiki T， Nakashima S， Nozawa Y， Moriwaki H. Lethal hepatic apoptosis mediated by tumor necrosis factor receptor， unlike Fas-mediated apoptosis， requires hepatocyte sensitization in mice. J Hepatol， 1999， 31（6）：997-1005.

[9] Zou H， McGarry TJ， Bernal T， Kirschner MW. Identification of a vertebrate sister-chromatid separation inhibitor involved in transformation and tumorigenesis. Science， 1999， 285（5426）：418-422.

[10] Romero F， Multon MC， Ramos-Morales F， Domínguez A， Bernal JA， Pintor-Toro JA， Tortolero M. Human securin， hPTTG， is associated with Ku heterodimer， the regulatory subunit of the DNA-dependent protein kinase. Nucleic Acids Res， 2001， 29（6）：1300-1307.

[11] Lum PY， Chen Y， Zhu J， Lamb J， Melmed S， Wang S， Drake TA， Lusis AJ， Schadt EE. Elucidating the murine brain transcriptional network in a segregating mouse population to identify core functional modules for obesity and diabetes. J Neurochem， 2006， 97 Suppl 1：50-62.

[12] Hunter JA， Skelly RH， Aylwin SJ， Geddes JF， Evanson J， Besser GM， Monson JP， Burrin JM. The relationship between pituitary tumour transforming gene （PTTG） expression and in vitro hormone and vascular endothelial growth factor （VEGF） secretion from human pituitary adenomas. Eur J Endocrinol， 2003， 148（2）：203-211.

[13] Li C， Wang Y， Wang S， Wu B， Hao J， Fan H， Ju Y， Ding Y， Chen L， Chu X， Liu W， Ye X， Meng S. Hepatitis B virus mRNA-mediated miR-122 inhibition upregulates PTTG1-binding protein， which promotes hepatocellular carcinoma tumor growth and cell invasion. J Virol， 2013， 87（4）：2193-2205.

[14] Molina-Jiménez F， Benedicto I， Murata M， Martín-Vílchez S， Seki T， Antonio Pintor-Toro J， Tortolero M， Moreno-Otero R， Okazaki K， Koike K， Barbero JL， Matsuzaki K， Majano PL， López-Cabrera M. Expression of pituitary tumor-transforming gene 1 （PTTG1）/securin in hepatitis B virus （HBV）-associated liver diseases： evidence for an HBV X protein-mediated inhibition of PTTG1 ubiquitination and degradation. Hepatology， 2010， 51（3）：777-787.

[15] 馮丹丹，楊碩，李紅霞，顧娜，閭軍. HCV感染通過Erk信號的激活上調(diào)PTTG1的表達. 科技導(dǎo)報，2012，30（13）：25-30.

[16] 彭善鑫，李長菲，孫璐，孟頌東. PTTG1通過P53促進HBV的復(fù)制. 微生物學(xué)報，2015， 55（7）：935-941.

[17] Shen S， Kong J， Qiu Y， Yang X， Wang W， Yan L. Identif-ication of core genes and outcomes in hepatocellular carcinoma by bioinformatics analysis. J Cell Biochem， 2019，120（6）：10069-10081.

[18] Guicciardi ME， Malhi H， Mott JL， Gores GJ. Apoptosis and necrosis in the liver. Compr Physiol， 2013， 3（2）：977-1010.

[19] 雷一鳴，楊逸冬，譚嗣偉，林顯藝，吳斌. TNF-α通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路誘導(dǎo)肝癌細胞自噬并促進增殖的研究.新醫(yī)學(xué)，2017，48（11）：770-774.

[20] Iurlaro R， Mu?oz-Pinedo C. Cell death induced by endoplasmic reticulum stress. FEBS J， 2016， 283（14）：2640-2652.

[21] Liang M， Chen X， Liu W， Li S， Li C， Jiang L， Lv S. Role of the pituitary tumor transforming gene 1 in the progression of hepatocellular carcinoma. Cancer Biol Ther， 2011， 11（3）：337-345.

（收稿日期：2019-12-25）

（本文編輯：楊江瑜）