5 例低磷酸酯酶癥患兒臨床及遺傳學(xué)分析

蘇 娜 朱 岷 許 珂 張惠姣

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室 國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地 兒科學(xué)重慶市重點實驗室（重慶 400014）；2.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院成都市婦女兒童中心醫(yī)院兒童遺傳與內(nèi)分泌代謝科（四川成都 610019）

低磷酸酯酶癥（hypophosphatasi，HPP，OMIM 146300，241500，241510）是以骨和/或牙齒礦化障礙，血清中組織非特異性堿性磷酸酶（tissue non-specific alkaline phosphatase，TNSALP）活性降低為主要臨床特征的一種罕見遺傳性疾病，1935 年首次報道，由加拿大兒科醫(yī)師Rathbun命名，故又稱Rathbun綜合征。輕型可僅表現(xiàn)為牙齒過早脫落、牙齒骨量減少、牙髓腔變大，而無骨骼異常表現(xiàn)，重型HPP 可出現(xiàn)嚴(yán)重骨骼異常、癲癇發(fā)作、繼發(fā)嚴(yán)重感染、呼吸衰竭及高鈣血癥而引發(fā)死亡，發(fā)病率1/300000～1/100000[1-2]。

HPP是由于編碼組織TNSALP的ALPL（the liver/bone/kidney alkaline phosphatase gene）基因突變所致，其遺傳方式較為復(fù)雜，在家系內(nèi)以常染色體顯性或隱性遺傳。ALPL基因位于lp 36.1-p 34 上，包含12 個外顯子，編碼一種磷酸單酯酶TNSALP，后者由524個氨基酸組成，包含活性區(qū)、N端螺旋區(qū)、同型二聚體結(jié)合區(qū)、冠狀區(qū)及鈣結(jié)合位點5 個結(jié)構(gòu)域[3]，以同型二聚體的形式通過C 端的糖基磷脂酰肌醇（glycophosphatidylinositol，GPI）錨點與細(xì)胞膜鏈接，定向使得活性位點面向胞外環(huán)境[4]，廣泛存在于各種組織中，尤以骨骼、肝臟、腎臟和發(fā)育中的牙齒分布較多。任何引起蛋白質(zhì)表達(dá)、折疊、修飾、轉(zhuǎn)運異常的ALPL基因突變，均可引起TNSALP量和質(zhì)的改變，從而引起HPP[5]。但TNSALP在骨骼和牙齒礦化中的具體機(jī)制還不十分明確[6]。本文回顧分析5例HPP患兒的臨床資料，以及高通量測序分析結(jié)果。

1 臨床資料

5 例HPP 患兒中，男3 例、女2 例，年齡在6 天～2歲5 個月，其中3 例為嬰兒型HPP，以骨骼畸形、骨礦化不全（圖1）及驚厥為主要臨床表現(xiàn)；2 例為兒童型HPP，以身材矮小、牙齒排列紊亂、骨質(zhì)疏松、長骨干骺端杯口樣改變（圖2）為主要臨床癥狀。5 例HPP 患兒的具體臨床資料見表1。

經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理審核及父母知情同意，采集患兒及其父母的外周血樣，送第三方檢測公司進(jìn)行人類全外顯子組高通量測序。采用Illumina TruSeq Exome library prep kit 捕獲全基因組構(gòu)建測序文庫，HiSeq v 4 SBS 250 cycles測序試劑盒，HiSeq 2500測序平臺進(jìn)行測序。所得的測序數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息分析，致病性預(yù)測（SIFT、Polyphen 2、MutationTaster、PROVEAN 等軟件），患兒臨床癥狀對照與家系遺傳分析，相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)查閱，候選基因突變位點根據(jù)ACMG（American College of Medical Genetics）、AMP（American Society of Molecular Pathology）指南進(jìn)行分類，并進(jìn)行一代測序（Sanger法）驗證。

表1 5例HPP患兒及親屬臨床資料

圖1 先證者1 影像表現(xiàn)

圖2 先證者3 影像表現(xiàn)

5 例HPP 患兒經(jīng)過測序共鑒定出6 個ALPL基因突變位點（表2）。行Sanger 驗證，先證者1 為雜合突變，突變來自母親；先證者2、3為復(fù)合雜合突變，常染色體隱性遺傳，父母均為攜帶者；先證者4純合突變，常染色體隱性遺傳，父母均為攜帶者；先證者5 位雜合突變，常染色體顯性遺傳，父親為患者，突變來自父親，見圖3。未發(fā)現(xiàn)新生突變（denovomutation）。6 個突變位點中c.1014_c.1015 ins G、c.1097_c.1099 del CCT、c.1446 C＞A 在千人數(shù)據(jù)庫、dbSNP 數(shù)據(jù)庫及hapmap數(shù)據(jù)庫中未查及相關(guān)記載，為首次報道，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測均為可能有害，ACMG評級為可能致病。

圖3 ALPL 基因測序結(jié)果

2 討論

HPP 臨床異質(zhì)性強(qiáng)，輕型易造成漏診和誤診，重型可危及生命。目前臨床分6 型：圍生期型、嬰兒型、兒童型、成年型、牙型。據(jù)國外文獻(xiàn)報道，TNSALP水平降低導(dǎo)致磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）的積累[7]可能會導(dǎo)致一些HPP嬰兒和實驗敲除ALPL基因小鼠癲癇發(fā)作。故嬰兒型HPP多在生后 6個月內(nèi)出現(xiàn)以驚厥等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主的臨床表現(xiàn)[8-9]，同時，驚厥也是重型HPP神經(jīng)系統(tǒng)的首要表現(xiàn)[9]，死亡率高達(dá)50%～90%。本研究中3 例嬰兒型HPP 具有驚厥等神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，死亡率100%。由此可見，面對驚厥的患兒，尤其是不明原因反復(fù)驚厥，并伴有骨骼異常的患兒，臨床醫(yī)師應(yīng)高度警惕HPP，并多方搜尋證據(jù)，全面分析。

表2 ALPL基因突變位點及Sanger驗證

目前，HPP 臨床診斷參考指標(biāo)包括：①血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）持續(xù)顯著降低，且臨床癥狀越重的患者，ALP 活性也越低[9]，但早孕、甲狀腺功能減退、貧血等患者也可出現(xiàn)ALP 降低，缺乏特異性；②尿磷酸乙醇胺（phosphoethanolamine，PEA），TNSALP 參與PEA 的代謝，作為代謝底物，PEA 容易檢測，但缺乏特異性，一些骨代謝疾病可出現(xiàn)尿PEA 陽性；③胎兒超聲，主要針對圍生期HPP；④X 線檢查示嚴(yán)重骨礦化不足，前臂或股骨突出皮膚的軟骨樣骨刺，對HPP 具有診斷意義；⑤針對有HPP家族史的高危人群或臨床疑診HPP患者的ALPL基因檢測可增加HPP 診斷的準(zhǔn)確性。目前，通過基因檢測可篩查出 95%的HPP 重癥患者[10]，是比血清ALP 檢測更可靠的診斷指標(biāo)。根據(jù)ALPL基因突變數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計數(shù)據(jù)（http://www.sesep.uvsq.fr/03_hypo_mutations.php），截至2019年10月2日，共報告397 種引起疾病的突變。最普遍的突變類型是錯義突變，占所有突變的70.0%，其次是小缺失，占11.8%。據(jù)筆者統(tǒng)計，目前國內(nèi)已報道ALPL基因突變42 種，78.57%為錯義突變。在除1 號外顯子以外的所有外顯子區(qū)域均有分布[11-15]，主要分布在5、10、12號外顯子，分別都有6種突變，同時，國內(nèi)已報道的病例中有6 例存在c.407位點的不同突變，是否存在突變熱點，尚需大樣本多中心數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。此次發(fā)現(xiàn)的突變中4例為錯義突變，1例小缺失，1例插入突變。

HPP的基因型和表型的變化都非常大，同一突變的不同患者輕重表型也不一致。本組患兒中先證者1的突變位點為c.346 G＞A，此位點突變的致病性既往已有報道，為齒型HPP，屬常染色體顯性遺傳[16]，研究者還發(fā)現(xiàn)該位點突變具有顯性負(fù)效應(yīng)[17]。本研究中，先證者1的母親與先證者1的基因型相同，但患兒母親僅有ALP 水平降低、骨痛和關(guān)節(jié)脫位等表現(xiàn)，為成人型輕型HPP，而患兒的臨床表現(xiàn)屬于嬰兒型重型HPP，臨床表現(xiàn)型并不一致，分析可能與環(huán)境因素與個體差異所致外顯不全有關(guān)。據(jù)既往報道，重型HPP多呈常染色體隱性遺傳，但先證者1 的家系遺傳學(xué)分析呈常染色體顯性遺傳，其生物學(xué)意義與家系遺傳學(xué)并不相符，分析可能與內(nèi)含子調(diào)控區(qū)域的測序盲區(qū)有關(guān)，同時環(huán)境因素與個體差異的作用不能除外，這有待進(jìn)一步研究。與此同時，先證者3 分別攜帶了來自父親的c.1446C＞A和母親的c.1014至c.1015:插入G突變，為復(fù)合雜合突變，根據(jù)其年齡和臨床表現(xiàn)診斷為兒童型輕型HPP，屬輕型。但其父母均為突變攜帶者且無臨床癥狀，故其遺傳方式符合常染色體隱性遺傳。因此在遺傳咨詢上，需警惕少數(shù)患兒盡管合并有兩個突變，但臨床表現(xiàn)型為輕型HPP的可能。先證者2及先證者3攜帶的c.1014_c.1015ins G、c.1097_c.1099del CCT、c.1446C＞A在千人數(shù)據(jù)庫、dbSNP數(shù)據(jù)庫及hapmap 數(shù)據(jù)庫中未查及相關(guān)記載，為首次報道，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測均為可能有害，ACMG 評級為可能致病，目前正在進(jìn)行體外細(xì)胞功能驗證。

綜上所述，對于臨床疑診HPP 患兒，應(yīng)首先檢測血清ALP水平，若血清ALP水平持續(xù)顯著下降，需進(jìn)一步進(jìn)行ALPL基因檢測，不僅有利于HPP 的早期診斷，也為患兒家庭進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供重要的理論依據(jù)。目前，HPP 發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)取得很大進(jìn)步，但輕型HPP 的患病率、臨床表型與基因型的相關(guān)性及調(diào)控機(jī)制，尚不明確，ALPL基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及內(nèi)含子區(qū)域的突變對蛋白質(zhì)功能的影響等許多問題仍需要進(jìn)行深入研究。