高效液相色譜法測定鐵皮石斛花中總黃酮的含量

農(nóng)彥彥，吳子瑜，林詩堃，黃 敏，李佳璐，馮才敏

（順德職業(yè)技術(shù)學(xué)院 輕化與材料學(xué)院，廣東 佛山 528333）

鐵皮石斛為蘭科植物，是以熱帶東南亞為中心向亞熱帶性氣候條件發(fā)展的一類植物［1］。鐵皮石斛一直與靈芝、人參和冬蟲夏草等被列為上品中藥，具有清肝明目、益胃生津［2］、滋陰清熱、潤肺止咳等功效［3］。目前，石斛屬植物的研究主要集中在藥用部位莖，關(guān)于石斛花的研究相對較少。前期研究發(fā)現(xiàn)［4-7］，鐵皮石斛花含有大量的黃酮類化合物與有機(jī)酸類、萜類等資源性成分，這些成分具有較強(qiáng)的生物活性，具有抗氧化、抗衰老、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫的功效。隨著石斛種植面積的不斷擴(kuò)大，石斛花資源也不斷豐富，越來越多的茶商收購石斛花將其開發(fā)成保健品花茶飲用，石斛花制成的花茶口感清香、柔滑，具有清新解郁、緩解精神壓力、潤膚養(yǎng)顏等多種功效［8-10］。蘆丁為石斛花中的主要黃酮類物質(zhì)，本試驗(yàn)通過探討石斛花中蘆丁含量的測定，建立石斛花活性成分（蘆丁）的HPLC 的分析方法，為石斛花的產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供參考，也為擴(kuò)大石斛藥材藥用部位提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

供試石斛花樣品由順德職業(yè)技術(shù)學(xué)院石斛組織培養(yǎng)課題組提供。

1.2 儀器與試劑

Agilent1260 高效液相色譜系統(tǒng)（二極管陣列檢測器）；LE204E/02 分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-500 型 高頻數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；A11 basic 分析研磨機(jī)（德國IKA）；Express 40 超純水機(jī)（MILLIPORE）

蘆丁對照品（純度：95%，批號：Lot#B1911032，Aladdin）；甲醇（色譜純）；乙酸（優(yōu)級純）。

1.3 溶液制備

1）對照品溶液的制備。

取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液。

2）供試品溶液的制備。

取供試品粗粉1.000 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率25 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流動相甲醇∶0.5%乙酸（V/V）為38∶62，流速1 mL/min，進(jìn)樣量 5 μL，檢測波長385 nm。理論板數(shù)按蘆丁計(jì)算，不應(yīng)低于2 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器對波長進(jìn)行掃描，取蘆丁對照品溶液，在200～800 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，測得最佳吸收波長為358 nm。此波長處吸收較大，干擾較小。因此，選擇358 nm 作為檢測波長。

2.2 流動相的選擇

分別以甲醇-水溶液，甲醇-0.5%磷酸水溶液，甲醇-0.5%乙酸水溶液作為流動相，同時以甲醇-0.5%乙酸水溶液不同配比對蘆丁對照品溶液和樣品溶液進(jìn)行測定。如圖1 所示，甲醇-0.5%乙酸水溶液的色譜峰分離效果較好，其中甲醇：0.5%乙酸水溶液=38∶62 配比靈敏度高，峰型平整，分離效果較好。

圖1 不同流動相種類對比圖譜

2.3 流速的選擇

高效液相色譜流速過高，不利于儀器和色譜柱的保護(hù)；流速過低，使目標(biāo)色譜峰的出峰時間延長，拉伸峰型，本實(shí)驗(yàn)以改變流速對蘆丁對照品進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2 所示，綜合考慮對色譜柱的保護(hù)和峰型的平整，試驗(yàn)選擇流速為1.1 mL/min。

2.4 進(jìn)樣量的選擇

進(jìn)樣量的高低取決了樣品的峰面積、保留時間和峰型的平整，本方法分別將自動進(jìn)樣器進(jìn)樣量調(diào)為3 μL，5 μL，10 μL，15 μL，20 μL，對蘆丁對照品進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3 所示，綜合考慮峰面積、保留時間和峰型，5 μL 進(jìn)樣量為最佳。

圖2 不同流速對比圖譜

圖3 不同進(jìn)樣量對比圖譜

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1）方法專屬性試驗(yàn)。

分別取蘆丁對照品溶液、供試品溶液進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4 圖5。

圖4 蘆丁對照品譜圖

圖5 供試品譜圖

2）線性關(guān)系。

取蘆丁對照品溶液，將自動進(jìn)樣器進(jìn)樣量分別調(diào)為0.4 μL、0.8 μL、1.2 μL、1.6 μL、2.0 μL，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，以蘆丁質(zhì)量（ng）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。如圖6 所示，表明蘆丁在0.04～0.2μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖6 蘆丁對照品標(biāo)曲線

3）精密度。

取對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，結(jié)果見圖7，可表明該方法下儀器精密度良好。

圖7 對照品重現(xiàn)性

4）重復(fù)性。

取鐵皮石斛花供試品溶液6 份，進(jìn)行測定，結(jié)果見圖8，表明該方法下樣品測定的重復(fù)性好。

圖8 樣品重現(xiàn)性

5）回收率。

精密量取鐵皮石斛花供試樣品液6 份，每份0.5 mL，分別精密加入蘆丁對照品溶液0.5 mL，混勻，進(jìn)樣測定，每份測定2 次，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1，由表可知，平均加樣回收率為 99.38%，該方法測定樣品準(zhǔn)確度較高。

表1 回收率

2.5 供試品測定

供試品溶液測定鐵皮石斛花微花期和盛花期總黃酮含量，由表2 顯示，微花期中總黃酮含量比盛花期總黃酮含量高。

表2 供試品測定

3 結(jié)論

建立高效液相色譜法測定鐵皮石斛花中總黃酮含量（以蘆丁計(jì)）的方法，蘆丁色譜峰峰形對稱，在濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率、精密度、重復(fù)性均符合含量測定的要求。

試驗(yàn)建立的HPLC 方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，適合鐵皮石斛花中總黃酮含量（以蘆丁計(jì)）的測定。同時，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微花期鐵皮石斛的黃酮含量比盛花期鐵皮石斛黃酮含量高，為石斛花資源開發(fā)利用和產(chǎn)品加工提供了參考依據(jù)。