0～3月齡嬰兒化膿性腦膜炎腦脊液病原菌分布及耐藥性分析

李雪琴 王 勤 王江濤 王曉玲 趙愛玲 谷惠茹

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院 鄭州兒童醫(yī)院，河南 鄭州 450018

化膿性腦膜炎(purulent meningitis，PM)又稱細(xì)菌性腦膜炎，是各種化膿性細(xì)菌引起的腦膜炎癥，部分患者病變累及腦實(shí)質(zhì)，嬰幼兒時(shí)期常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，嬰幼兒病死率10%，10%～20%的幸存者遺留各種神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重后遺癥。PM后最常見的中度到重度后遺癥是感覺神經(jīng)性聽力損失、神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙和智力低下，輕微的后遺癥包括學(xué)習(xí)和行為障礙[1]。PM在出生后的第1個(gè)月比其他任何時(shí)期更常見，而且在嬰兒中經(jīng)常伴有早發(fā)型敗血癥和晚發(fā)型敗血癥[2]。頭骨、脊椎、腦膜、血腦和血腦脊液界面的細(xì)胞屏障能很好地保護(hù)大腦和腦膜免受微生物入侵。然而，一旦進(jìn)入血液，一系列病原菌就可能到達(dá)大腦并引起腦膜炎[3]。因此，早診斷、有效治療對(duì)于PM的預(yù)后具有重要意義。腦脊液(erebrospinal fluid，CSF)檢查是目前確診本病的重要依據(jù)，為使患兒得到更有效的治療，需了解PM的常見病原體及耐藥情況。

多重耐藥菌(multi-drug resistant organisms，MDRO)主要是指對(duì)臨床使用的三類或三類以上抗菌藥物同時(shí)呈現(xiàn)耐藥的菌株。目前，由MDRO引起的嚴(yán)重感染的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，越來越多的新生兒和兒童因耐藥細(xì)菌而發(fā)生嚴(yán)重的血液感染[4]。0～3月齡PM患兒CSF病原菌的分布及耐藥情況目前國內(nèi)外報(bào)道甚少，本文對(duì)2015-01-01—2019-12-31在鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒診療中心住院的0～3月齡PM患兒175株CSF培養(yǎng)陽性病原體進(jìn)行回顧性分析，了解不同年齡段的PM患兒的病原體分布及隨時(shí)間推移病原體的變遷，并將PM患兒病原菌的耐藥情況作了進(jìn)一步分析。

1 材料與方法

1．1標(biāo)本來源及納入標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本來源于2015-01-01—2019-12-31在鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒診療中心住院的0～3月齡患兒送檢的5 310份腦脊液標(biāo)本，共培養(yǎng)出陽性病原體175株，來自161位PM患兒，男女比例為1.3∶1，其中14例患兒CSF培養(yǎng)檢測(cè)出2種病原體。同一患兒在同一住院期間分離的相同菌株不計(jì)入細(xì)菌總數(shù)。所有菌株按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)及鑒定。

納入標(biāo)準(zhǔn)：161例CSF培養(yǎng)陽性的研究對(duì)象，其臨床表現(xiàn)、病原學(xué)檢查、血液非特異性檢查及CSF檢查均符合人民衛(wèi)生出版社《兒科學(xué)》第9版化膿性腦膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡0～3月齡。

1．2儀器及方法為了解不同年齡組CSF病原菌分布情況，將0～3月齡入選患兒分為3組：早期新生兒組(0～7 d)、晚期新生兒組(8～28 d)及29 d～3月齡小嬰兒組。CSF培養(yǎng)：對(duì)臨床可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患兒，嚴(yán)格無菌操作下采集CSF 1～2 mL，1 h內(nèi)送微生物室進(jìn)行培養(yǎng)。按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行培養(yǎng)、分離、鑒定。采用德國bruker質(zhì)譜儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定，藥敏試驗(yàn)采用法國梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)和美國BD全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，藥敏試驗(yàn)采用MIC法，若培養(yǎng)5 d仍為陰性則報(bào)告陰性。

1．3結(jié)果判定檢出率是指被檢標(biāo)本中陽性標(biāo)本出現(xiàn)的百分率。耐藥率是指耐藥菌株占總檢出菌株的百分比。構(gòu)成比是表示某事物內(nèi)部各組成部分在整體中所占的比重。最小抑菌濃度(MIC)指在體外能達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小抗菌藥物濃度。藥敏判定結(jié)果按照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的最新版《抗微生物敏感性試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》要求進(jìn)行。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用率或百分比(%)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本組患兒CSF培養(yǎng)共檢出病原菌175珠，檢出率3.3%(175/5310)。以革蘭陽性(gram-positive，G+)菌為主，構(gòu)成比68%(119/175)，革蘭陰性(gram-negative，G-)菌的構(gòu)成比為32%(56/175)。構(gòu)成比排名前7位的分別為大腸埃希菌(34株)、表皮葡萄球菌(25株)、屎腸球菌(23株)、溶血葡萄球菌(17株)、人葡萄球菌(14株)、肺炎克雷伯菌(13株)；B群無乳鏈球菌(group B Streptococcus，GBS)(10株)。

2．1CSF培養(yǎng)病原菌的年齡組分布早期新生兒組檢出41株，G+菌占73.2%(30/41)，G-菌占26.8%(11/41)；晚期新生兒組檢出71株，G+菌占62%(44/71)，G-菌占38%(27/71)；29 d～3月齡小嬰兒檢出63株，G+菌占71.4%(45/63)，G-菌占28.6%(18/63)。3個(gè)年齡組病原菌G+菌、G-菌構(gòu)成比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同年齡組 G+菌、G-菌構(gòu)成比比較

注：χ2=2.03，P=0.374

不同年齡組患兒的CSF菌株構(gòu)成比排名又不盡相同。早期新生兒組排名前5位的菌株分別為表皮葡萄球菌 (12.2%，5/41)、肺炎克雷伯菌(12.2%，5/41)、GBS(9.8%，4/41)、人葡萄球菌(9.8%，4/41)、屎腸球菌(9.8%，4/41)；晚期新生兒組排名前5位的分別為大腸埃希菌 (25.3%，18/71)、表皮葡萄球菌(14.1%，10/71)、溶血葡萄球菌(14.1%，10/71)、屎腸球菌(12.7%，9/71)、肺炎克雷伯菌(8.5%，6/71)；29 d～3月齡小嬰兒組排名前5位的分別為：大腸埃希菌(19.0%，12/63)、表皮葡萄球菌(15.9%，10/63)、屎腸球菌(15.9%，10/63)、人葡萄球菌(9.5%，6/63)、金黃色葡萄球菌(7.9%，5/63)。

2．2前后2.5aCSF培養(yǎng)病原菌檢出情況比較2015-01-01—2017-06-30本中心PM患兒CSF培養(yǎng)共檢出病原菌86株，其中G+病原菌64株，G-病原菌22株；2017-07-01—2019-12-31 CSF培養(yǎng)共檢出病原菌89株，其中G+病原菌55株，G-病原菌34株。前后2.5 a比較，G+病原菌構(gòu)成比呈下降趨勢(shì)，G-病原菌構(gòu)成比有上升趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2．3CSF培養(yǎng)藥敏結(jié)果

2．3．1 CSF培養(yǎng)MDRO分布：本中心CSF培養(yǎng)病原菌共檢出MDRO 77株，耐藥率44%(77/175)，構(gòu)成比排名前5位的MDRO依次為耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(methicillin-resistant coagulase negative staphylococci，MRCNS)(32.5%，25/77)、產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBLs)菌株(22.1%，17/77)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus epidermidis，MRSE)(19.5%，15/77)、碳青霉烯類耐藥腸桿菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)(14.3%，11/77)、氨基糖苷類高水平耐藥 (high-level aminoglycoside resistant，HLAR)菌株(7.8%，6/77)。6株HLAR菌株全部為屎腸球菌；17株ESBLs菌株中15株為大腸埃希菌菌，2株為肺炎克雷伯菌；11株CRE菌株中10株為肺炎克雷伯菌，1株為大腸埃希菌。CSF病原菌中G-菌的耐藥率(58.9%，44/119)明顯高于G+菌的耐藥率(37%，33/56)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 前后2.5 a G+菌、G-菌構(gòu)成比比較

注：χ2=3.202，P=0.078

表3 CSF中G+及G-菌株耐藥率比較

注：χ2=7.449，P=0.009

2．3．2 CSF培養(yǎng)病原菌對(duì)常用抗生素耐藥情況：本中心CSF培養(yǎng)構(gòu)成比排名前6位的病原菌G-菌株包括大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌，G+菌株包括表皮葡萄球菌、屎腸球菌、溶血葡萄球菌及人葡萄球菌。檢出率較高的G+菌株對(duì)常用抗生素的耐藥情況見表4，G-菌株對(duì)常用抗生素的耐藥情況見表5。大腸埃希菌耐藥率為0的僅有阿米克星，哌拉西林耐藥率為100%，耐藥率<10%的有美羅培南、亞胺培南、哌拉西林他唑巴坦。肺炎克雷伯菌耐藥率均在50%以上，美羅培南、亞胺培南、哌拉西林他唑巴坦耐藥率均為83.3%。表皮葡萄球菌、屎腸球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌對(duì)萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺的耐藥率均為0。表皮葡萄球菌對(duì)氨芐西林及青霉素的耐藥率均為100%，溶血葡萄球菌對(duì)紅霉素的耐藥率為100%，屎腸球菌對(duì)克林霉素、利福平、復(fù)方新諾明及阿米卡星的耐藥率均為100%。真菌對(duì)常用抗真菌藥物均敏感。

表4 G+菌株對(duì)常用抗生素的耐藥率

3 討論

2015—2019年鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒診療中心共收集0～3月齡PM患兒CSF培養(yǎng)陽性病原菌175珠，總檢出率3.3%(175/5 310)，明顯低于我國華南部分地區(qū)新生兒細(xì)菌性腦膜炎腦脊液的病原體陽性培養(yǎng)率33.0%[5]，考慮與我院臨床醫(yī)師更重視腦CSF原菌的培養(yǎng)，CSF標(biāo)本送檢率較高有關(guān)，其中一部分患兒最終并未臨床診斷為PM，至CSF病原菌陽性檢出率較低；另外，考慮與本院患兒大多數(shù)是由外院轉(zhuǎn)診入院，在進(jìn)行CSF培養(yǎng)前已應(yīng)用抗菌藥物有關(guān)。目前已有利用基因測(cè)序快速診斷細(xì)菌性腦膜炎的檢測(cè)方法[6-7]，在此技術(shù)還未廣泛應(yīng)用于臨床之前，雖然CSF培養(yǎng)陽性率較低，但仍能夠有效指導(dǎo)臨床合理用藥。

不同年齡段的PM患者CSF常見病原菌亦存在差異。成人及兒童PM病原體有很大差別，方霞等[8]報(bào)道當(dāng)?shù)爻扇薖M病原體以新型隱球菌感染為主，但兒童新型隱球菌感染少見。不同年齡段的兒童PM病原體亦有差異，文獻(xiàn)報(bào)道新生兒PM最常見的病原菌是GBS和大腸埃希菌[3]。本研究0～3月齡PM患兒CSF病原菌檢出率排名前7位的分別為大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、屎腸球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、GBS，G+菌構(gòu)成比68%(119/175)，G-菌的構(gòu)成比為32%(56/175)。本文GBS檢出率較國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道低，考慮可能與我院沒有產(chǎn)科，患兒主要來源為各地危重癥患兒轉(zhuǎn)診，可能存在大量輕癥GBS患兒未到我院就診有關(guān)。

表5 G-菌株對(duì)常用抗生素的耐藥率

本文早期新生兒組GBS構(gòu)成比排名較其他兩組靠前，考慮與孕母GBS感染所致宮內(nèi)感染或經(jīng)陰道分泌物垂直傳播有關(guān)。晚期新生兒及小嬰兒組CSF培養(yǎng)大腸埃希菌構(gòu)成比均排名第1位，與ZHAO等[9]的報(bào)道相符，考慮與此年齡段患兒易暴露于大腸埃希菌有關(guān)。同時(shí)，我院住院新生兒多為醫(yī)聯(lián)體單位轉(zhuǎn)診的重癥患兒，機(jī)械通氣的比率較高，外院住院有應(yīng)用抗菌藥物史，醫(yī)院感染率較高亦不能除外。68%的G+菌中以凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase negative staphylococci，CNS)為主，CNS是皮膚、口腔黏膜等部位的正常菌群，以往臨床中常把CNS視為污染菌，但近年來國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道CSF培養(yǎng)陽性菌主要為CNS[10]，國外文獻(xiàn)亦有條件葡萄球菌致人類腦膜炎的報(bào)道[11]，因此，當(dāng)CSF中檢出CNS，應(yīng)結(jié)合患兒的臨床表現(xiàn)和CSF常規(guī)、生化、血培養(yǎng)等檢查結(jié)果判斷是否為致病菌，避免不合理用藥。

本中心2015-01-01—2017-06-30 PM患兒CSF培養(yǎng)檢出細(xì)菌中G+菌構(gòu)成比為74.4%，G-菌構(gòu)成比為25.6%，2017-07-01—2019-12-31 PM患兒CSF培養(yǎng)檢出細(xì)菌中G+菌構(gòu)成比為61.8%，G-菌構(gòu)成比為38.2%，前后2.5 a比較，G+菌構(gòu)成比呈下降趨勢(shì)，G-菌構(gòu)成比呈升高趨勢(shì)，雖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.078)，但已有文獻(xiàn)報(bào)道新生兒CSF培養(yǎng)病原菌中G-菌有逐年上升趨勢(shì)[10]，應(yīng)繼續(xù)監(jiān)測(cè)其動(dòng)態(tài)變化。

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，病原菌耐藥現(xiàn)象已引起全球關(guān)注。已有文獻(xiàn)綜述抗生素的使用與隨后的醫(yī)院感染或MDRO在兒童中的定植之間呈正相關(guān)[12]。本研究PM患兒CSF培養(yǎng)病原菌的多重耐藥率高達(dá)(44%)，G-菌的耐藥率(58.9%)高于G+菌(37%)(P<0.05)。檢出率排名前5位的MDRO重點(diǎn)菌分別為MRCNS、ESBLs菌株、MRSE、CRE、HLAR菌株。6株HLAR菌株全部為屎腸球菌，ESBLs菌株中主要為大腸埃希菌(88.2%)，CRE菌株中主要為肺炎克雷伯菌(88.2%)。段雪亞等[13]報(bào)道當(dāng)?shù)厣窠?jīng)內(nèi)外科住院患者CRE中肺炎克雷伯菌占86.78%，F(xiàn)ANG等[14]報(bào)道肺炎克雷伯菌是CRE的主要分離株，占標(biāo)本的74.5%，與本研究結(jié)果基本相符。近幾年來，CRE在世界范圍內(nèi)迅速蔓延，給人類健康帶來了巨大的挑戰(zhàn)，質(zhì)粒介導(dǎo)的碳青霉烯類耐藥基因水平傳播是CRE流行激增的主要原因。產(chǎn)生對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥性的主要機(jī)制有3種：酶的產(chǎn)生、外排泵和孔蛋白突變，其中酶的產(chǎn)生是主要的抗性機(jī)制，對(duì)碳青霉烯類耐藥主要有三類酶，所有這3組酶都是質(zhì)粒介導(dǎo)的[15]。治療CRE感染的一線抗生素目前為多黏菌素，與多黏菌素相比，新的抗CRE抗生素，如頭孢他啶-阿維巴坦、美羅培南-瓦博巴坦、廣場(chǎng)霉素改善了CRE感染患者的預(yù)后，并降低了毒性，有望成為一線用藥[16]。MRCNS為低毒性條件致病菌，感染后癥狀不典型，且呈多重耐藥現(xiàn)象，給臨床診斷及治療帶來一定難度。加強(qiáng)感染預(yù)防，包括手部衛(wèi)生、監(jiān)測(cè)培養(yǎng)、接觸預(yù)防、選擇性隔離和抗生素管理是減少病區(qū)耐藥性的重要策略[17]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道個(gè)性化檢測(cè)病原菌可能與降低ICU中的MDRO有關(guān)[18]。相關(guān)疫苗研制也為人類預(yù)防及治療細(xì)菌性腦膜炎帶來了希望。研究顯示，部分益生菌具有抗CRE活性，為控制或預(yù)防CRE定植或感染提供了潛在的應(yīng)用前景[19]。

目前，有關(guān)G+菌株耐藥的報(bào)道逐年增多。本中心CSF中表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌對(duì)萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺的耐藥率均為0，對(duì)青霉素的耐藥率分別為100%、87.5%、92.9%，提示青霉素已不再是治療PM的首選抗菌藥物。屎腸球菌對(duì)克林霉素、利福平、復(fù)方新諾明、慶大霉素、阿米卡星耐藥率均為100%，臨床不宜選用，對(duì)萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺的耐藥率均為0，因此，這3種藥物對(duì)耐藥的屎腸球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌感染的治療效果相對(duì)可靠。文獻(xiàn)報(bào)道呋喃妥因?qū)θf古霉素耐藥的腸球菌具有較好的體外抗菌作用[20]，本研究中屎腸球菌對(duì)呋喃妥因的耐藥率為僅9.1%，僅次于萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺，所以呋喃妥因亦為臨床治療提供了新的選擇。本研究顯示G-菌的耐藥率明顯高于G+菌。大腸埃希菌對(duì)哌拉西林耐藥率為100%，對(duì)氨芐西林的耐藥率為96.7%，但對(duì)哌拉西林他唑巴坦、亞胺培南、美羅培南的耐藥率在10%以內(nèi)，對(duì)阿米卡星耐藥率為0，可供臨床選用抗菌藥物參考。肺炎克雷伯菌的耐藥率除莫西沙星(50%)和氯霉素(63.6%)外，其他常用抗菌藥物耐藥率均在70%以上，臨床選藥比較困難。最近研究表明，對(duì)抗細(xì)菌穿透血腦屏障的靶點(diǎn)在改善細(xì)菌性腦膜炎的預(yù)后方面是抗菌治療的有益輔助治療手段[21]。建立機(jī)構(gòu)抗菌藥物管理計(jì)劃被認(rèn)為是減少醫(yī)院抗生素消費(fèi)和解決MDRO高比率的關(guān)鍵干預(yù)措施。

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院0～3月齡PM患兒CSF病原菌以G+菌為主，大多數(shù)是條件致病菌，G-菌的耐藥率高于G+，考慮因近年來大量廣譜抗菌藥物的廣泛使用所致。不同年齡組病原菌分布又有所差別。臨床醫(yī)生詳細(xì)了解病區(qū)感染病原菌分布及耐藥性變化趨勢(shì)，能更有針對(duì)性地應(yīng)用抗菌藥物，指導(dǎo)臨床治療。