臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的質(zhì)量管理及有效性和安全性

王佃亮

國內(nèi)外利用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑進(jìn)行的動物模型試驗、臨床研究和臨床移植治療表明，不同的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑療效差別很大[1-5]。究其原因，可能與疾病種類、治療時機、使用劑量、移植途徑、個體差異等因素有關(guān)，但主要還是由干細(xì)胞制劑的質(zhì)量差異導(dǎo)致的。造成臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑質(zhì)量差異的因素很多，主要包括細(xì)胞來源的組織材料、分離制備方法及過程、檢測鑒定方法及過程、傳代方法及過程、擴增方法及過程、制劑配制添加成分及配制方法和過程、冷藏或冷凍保存方法及過程、復(fù)蘇方法及過程、操作人員技能差異等。干細(xì)胞制劑的質(zhì)量與干細(xì)胞治療的有效性和安全性有關(guān)，是干細(xì)胞臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。

1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的質(zhì)量管理

臨床級的干細(xì)胞制劑以人體疾病治療為目的，其生產(chǎn)和管理應(yīng)遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》(good manufacturing practice,GMP)、《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》(國家食品藥品監(jiān)督管理局2003年3月頒布)、《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則(試行)》(國家衛(wèi)生計生委、食品藥品監(jiān)督管理總局2015年7月頒布)、《干細(xì)胞制劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范》(中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會2016年10月發(fā)布)、《干細(xì)胞通用要求》(中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會干細(xì)胞生物學(xué)分會2017年11月發(fā)布)等國家法規(guī)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑生產(chǎn)過程中，需要嚴(yán)格遵守這些法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，提高質(zhì)量。

1.1 制劑制備過程及所用材料的質(zhì)量管理 預(yù)先制定新生兒臍帶采集及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離純化、原代培養(yǎng)、傳代擴增、細(xì)胞鑒定、細(xì)胞系建立、冷凍保存、干細(xì)胞注射液配制和保存的標(biāo)準(zhǔn)操作及質(zhì)量管理程序，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(表1)，并在符合GMP要求基礎(chǔ)上嚴(yán)格執(zhí)行。

表1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

新生兒臍帶樣本的采集場所應(yīng)達(dá)到Ⅱ級一般潔凈手術(shù)室要求，保證無菌采集環(huán)境。采集前，選擇健康足月產(chǎn)婦，保證：①獲得產(chǎn)婦本人、法定代表人或監(jiān)護(hù)人同意，簽署知情同意書；②經(jīng)檢驗產(chǎn)婦乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、艾滋病病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒(human T cell lymphotropic virus，HTLV)、梅毒螺旋體、支原體、霉菌等病原體均為陰性；③產(chǎn)婦本人及家族成員無遺傳病、傳染病、精神病或其他重大疾病現(xiàn)病史和既往病史。采集時，待胎兒娩出，立刻用蘸有75%酒精的紗布擦拭臍帶，截取至少15 cm無針孔的臍帶放入保存液中，置于無菌采集袋里，標(biāo)識清楚，臍帶兩端用手術(shù)線結(jié)扎。

在無菌室操作臺上，從新生兒臍帶組織剝?nèi)∪A通氏膠，以組織塊培養(yǎng)法或酶消化法分離新生兒間充質(zhì)干細(xì)胞，貼壁法做原代培養(yǎng)。培養(yǎng)液中若加有牛血清、豬胰酶，除要求供應(yīng)商提供企業(yè)合法生產(chǎn)資質(zhì)、產(chǎn)品合格證及說明書等信息外，還要檢測牛、豬來源的危險致病病毒。傳代培養(yǎng)要有明確的細(xì)胞鑒別特征，細(xì)胞純度和活性達(dá)到臨床要求，并且無內(nèi)外源微生物污染。經(jīng)傳代和擴增培養(yǎng)后達(dá)到一定數(shù)量的細(xì)胞系，可以進(jìn)行冷凍保存。凍存細(xì)胞需加入合適的冷凍保護(hù)液，在程序降溫條件下進(jìn)行冷凍。凍存好的細(xì)胞移至液氮罐中(-196～-135 ℃)長期儲存。建立主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫，減少不同批次臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在操作過程中的變異性[8]。

干細(xì)胞培養(yǎng)液添加物、干細(xì)胞注射液配制所需的溶媒和添加物都要有合法的來源，生產(chǎn)企業(yè)有相應(yīng)資質(zhì)，能夠提供產(chǎn)品合格證和說明書等信息。干細(xì)胞制備及制劑配制的相關(guān)重要信息(如：干細(xì)胞供者的年齡、民族、血型、現(xiàn)病史、既往病史等；干細(xì)胞制劑的生產(chǎn)日期、批號、有效期、入庫時間、出庫時間等)應(yīng)錄入計算機系統(tǒng)進(jìn)行管理，核心數(shù)據(jù)信息要進(jìn)行備份，以防感染計算機病毒或遭黑客襲擊丟失信息。

1.2 制劑的質(zhì)量檢測 臨床移植治療用的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，需要經(jīng)過細(xì)胞檢測、制劑檢測、放行檢測以及質(zhì)量復(fù)核等程序。

1.2.1 細(xì)胞檢測 包括但不限于：①細(xì)胞鑒別：通過細(xì)胞形態(tài)、遺傳學(xué)、代謝酶亞型譜分析、表面標(biāo)志物、特定基因表達(dá)產(chǎn)物等檢測，對不同供體的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行綜合的細(xì)胞鑒別。在倒置顯微鏡下觀察，體外微組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)的原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在第6～8天開始有少量細(xì)胞從組織塊中爬出，沿組織周圍向外呈放射狀延伸生長，吹打去除組織塊后呈旋渦狀生長，細(xì)胞呈梭形，與皮膚成纖維細(xì)胞類似，形態(tài)相對均一。原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞長滿瓶底并達(dá)到90%融合時間為18～20 d。傳代培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長速度比原代快，24 h內(nèi)可見少量貼壁的圓型細(xì)胞，逐漸呈克隆式生長，到3 d左右時，大多數(shù)呈梭形，部分呈多邊或多角形，長滿瓶底后基本呈梭形，旋渦狀生長。根據(jù)其生長形態(tài)和特征，結(jié)合組織來源，可初步鑒別臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。在通過表面標(biāo)志物等分析，可明確鑒定。正常二倍體細(xì)胞核型，為46 XY或46 XX；CD29、CD44、CD73、CD105、CD90陽性，陽性率大于95%；HLA-DR、CD34、 CD31、CD45陰性，表達(dá)小于2%等。②存活率和生長活性：采用多種細(xì)胞生物學(xué)活性檢測方法，如活細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞倍增時間、細(xì)胞周期、克隆形成率、端粒酶活性等判斷細(xì)胞活性和生長情況。存活率不低于95%；體外擴增人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞潛伏期為1～2 d，對數(shù)生長期為3～7 d，第8天以后長滿瓶底轉(zhuǎn)入平臺期，生長停滯，傳代培養(yǎng)增殖倍數(shù)為5～6倍；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞85%以上處于G0/G1期，G2/M期占5%以下，S期細(xì)胞占10%以下。③純度、均一性及最低裝量：通過肉眼觀察、檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物和遺傳多態(tài)性及特定生物學(xué)活性等，對制劑進(jìn)行細(xì)胞純度或均一性的檢測；用最低裝量檢查法檢查最低裝量。標(biāo)準(zhǔn)和參數(shù)為白色均勻懸濁液，無明顯沉淀，無異物。每劑的最低裝量應(yīng)為(20±2)mL。④無菌試驗和細(xì)菌、真菌、支原體、梅毒螺旋體檢測：依據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》中生物制品無菌試驗和支原體檢測規(guī)程，對細(xì)菌、真菌、支原體污染進(jìn)行檢測。標(biāo)準(zhǔn)和參數(shù)為：應(yīng)無菌生長；細(xì)菌、支原體、真菌、梅毒螺旋體檢測為陰性。⑤細(xì)胞內(nèi)外源致病因子檢測：應(yīng)結(jié)合體內(nèi)和體外方法，根據(jù)每一細(xì)胞制劑的特性進(jìn)行人源及動物源性特定致病因子，利用PCR技術(shù)、酶聯(lián)免疫法等進(jìn)行檢測。如使用過牛血清，須進(jìn)行牛源特定病毒的檢測；如使用胰酶等豬源材料，應(yīng)至少檢測豬源細(xì)小病毒。另外，還應(yīng)檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒(如HIV)。標(biāo)準(zhǔn)和參數(shù)為：HBV、HCV、HIV、EBV、CMV、HTLV、牛海綿狀腦病病毒、豬細(xì)小病毒等檢測應(yīng)為陰性。⑥內(nèi)毒素檢測：依據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》中內(nèi)毒素檢測規(guī)程中的凝膠法，對內(nèi)毒素進(jìn)行檢測。內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)為≤50 EU。⑦異常免疫學(xué)反應(yīng)檢測：檢測異體來源干細(xì)胞對人總淋巴細(xì)胞增殖和對不同淋巴細(xì)胞亞群增殖能力的影響，或?qū)ο嚓P(guān)細(xì)胞因子分泌的影響，分析可能引起的異常免疫反應(yīng)。判定標(biāo)準(zhǔn)為間充質(zhì)干細(xì)胞濃度為2×105/mL時，對T淋巴細(xì)胞增殖抑制率不低于50%。⑧致瘤性和促瘤性檢驗：對于異體來源的干細(xì)胞制劑或經(jīng)體外復(fù)雜操作的自體干細(xì)胞制劑，須通過免疫缺陷動物體內(nèi)致瘤試驗，檢驗細(xì)胞的致瘤性。判定標(biāo)準(zhǔn)為無致瘤性。⑨生物學(xué)效力試驗：通過檢測干細(xì)胞分化潛能、誘導(dǎo)分化細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理功能、對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力、分泌特定細(xì)胞因子、表達(dá)特定基因和蛋白等功能，判斷干細(xì)胞制劑與治療相關(guān)的生物學(xué)有效性。對間充質(zhì)干細(xì)胞，無論何種來源，應(yīng)進(jìn)行體外多種類型細(xì)胞(如成脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等)分化能力的檢測，以判斷其細(xì)胞分化的多能性。除此以外，作為特定生物學(xué)效應(yīng)試驗，應(yīng)進(jìn)行與其治療適應(yīng)證相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)檢驗。判定標(biāo)準(zhǔn)為應(yīng)具有相應(yīng)生物學(xué)功能。⑩細(xì)胞培養(yǎng)基及其他添加成分殘余量的檢測：對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制備過程中殘余的、影響臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑質(zhì)量和安全性的成分，如牛血清白蛋白、抗生素、細(xì)胞因子等進(jìn)行檢測。注射劑中牛血清殘留量檢測使用牛血清白蛋白酶聯(lián)免疫法或間接凝集法，判定標(biāo)準(zhǔn)為牛血清殘留量不得大于50 ng/mL；細(xì)胞注射劑抗生素殘留量檢測采取培養(yǎng)法，標(biāo)準(zhǔn)為陰性；人表皮生長因子采用ELISA的方法檢測，應(yīng)不大于100 pg/mL。

1.2.2 制劑檢測 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑(注射液)是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與0.9%的生理鹽水或復(fù)方電解質(zhì)注射液(基礎(chǔ)溶媒)、L-谷氨酰胺或腺苷(能源物質(zhì))、N-乙酰半胱氨酸或亞硒酸鈉(抗氧化劑)、胰島素(活性生長因子)、肝素鈣(抗凝劑)、甘油或二甲亞砜(滲透性細(xì)胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑)、人血白蛋白或葡聚糖(非滲透性細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑)等成分配制而成。它的檢測是在干細(xì)胞檢測的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測制劑中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)、存活率、生長活性等，檢測制劑的純度和均一性、微生物病原體、內(nèi)毒素、異常免疫反應(yīng)、致瘤性、促瘤性、生物學(xué)效力等。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞注射劑的包裝必須采取符合2015版《中華人民共和國藥典》的包裝要求，包裝材料必須無菌、無色透明、不吸附細(xì)胞，不影響細(xì)胞活性；制備的細(xì)胞注射劑成品外觀肉眼觀察應(yīng)為白色均勻混懸液，無明顯的沉淀物、無異物；每劑的最低裝量應(yīng)為(20±2)mL。

1.2.3 放行檢測 針對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的特性，制定放行檢測項目和標(biāo)準(zhǔn)。放行檢測項目應(yīng)能在相對短的時間內(nèi)，反映臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的質(zhì)量和安全信息。

1.2.4 質(zhì)量復(fù)核 由專業(yè)細(xì)胞檢驗機構(gòu)或?qū)嶒炇疫M(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的質(zhì)量復(fù)核檢驗，并出具正規(guī)的檢驗報告。

1.3 制劑的穩(wěn)定性 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的穩(wěn)定性是指制劑在儲存(液氮凍存和細(xì)胞植入前的臨時存放)和運輸過程中的物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的改變。檢測項目包括細(xì)胞形態(tài)、活性、存活率、密度、純度、無菌性等。穩(wěn)定性檢測的關(guān)鍵是制劑中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量和活性的改變，直接影響到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療的效果。

根據(jù)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑穩(wěn)定性檢測結(jié)果，確定制劑的保存液成份與配方、保存和運輸條件、有效期，同時確定與有效期相適應(yīng)的運輸容器和工具，以及合格的細(xì)胞凍存設(shè)施和條件。

2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的有效性

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的有效性可利用細(xì)胞模型和動物模型在臨床前研究階段進(jìn)行評估[9]。①細(xì)胞模型通過檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能、誘導(dǎo)分化細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理功能、對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力、分泌特定細(xì)胞因子、表達(dá)特定基因和蛋白等功能，判斷臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑與治療相關(guān)的生物學(xué)有效性。對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外多種類型細(xì)胞(成脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等)分化能力的檢測，以判斷細(xì)胞分化的多能性。作為特定生物學(xué)效應(yīng)試驗，應(yīng)進(jìn)行與治療適應(yīng)證相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)檢驗。隨著研究的進(jìn)展，針對臨床治療的適應(yīng)證，會不斷研究更新生物學(xué)效應(yīng)檢測方法。如研究介導(dǎo)臨床治療效應(yīng)的關(guān)鍵基因或蛋白的表達(dá)，并以此為基礎(chǔ)提出與預(yù)期的生物學(xué)效應(yīng)相關(guān)的替代性生物標(biāo)志物。②動物模型用于觀察植入的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞或其分化產(chǎn)物改變模型中疾病的病理進(jìn)程；研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢能力和免疫調(diào)節(jié)功能；通過分析臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞植入后特定細(xì)胞因子和(或)特定基因表達(dá)情況，提出替代性生物學(xué)效應(yīng)標(biāo)志物。

國內(nèi)外眾多臨床研究和治療病例表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可用于自身免疫性疾病、退行性疾病、神經(jīng)性疾病、衰老性疾病、遺傳缺陷、組織器官損傷、放射病、炎癥等病癥的治療[10-12]，包括兒童移植物抗宿主病、克羅恩病、創(chuàng)傷、缺血性損傷、造血功能障礙、骨及軟骨損傷、神經(jīng)損傷、肌營養(yǎng)不良、糖尿病及其并發(fā)癥、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝硬化、肝纖維化、酒精性肝病、肝功能衰竭、腎功能衰竭、急性心肌梗死、腦梗死、腫瘤、視網(wǎng)膜黃斑變性、帕金森病、老年癡呆癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、系統(tǒng)性硬化癥、原發(fā)性干燥綜合征、皮肌炎等難治性疾病。此外，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是比較理想的組織工程種子細(xì)胞，可用于體外或體內(nèi)再生組織器官，進(jìn)行臨床治療。

3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的安全性

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的安全性包括生物學(xué)安全、病原生物安全、倫理學(xué)安全等[9]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源于產(chǎn)婦產(chǎn)后的臍帶組織，通常情況下是作為醫(yī)療廢物丟棄的，從臍帶組織中分離提取干細(xì)胞不存在倫理爭議，可以用于臨床治療，在倫理學(xué)上是安全的，這一點與某些胚胎干細(xì)胞不同[13-15]。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的生物學(xué)安全主要是指毒性反應(yīng)、異常免疫學(xué)反應(yīng)、非預(yù)期分化、致瘤性和促瘤性等。①毒性反應(yīng)：通過合適的動物實驗?zāi)Ｐ?，觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑各種可能的毒性反應(yīng)，譬如，細(xì)胞植入時和植入后的局部和整體的毒性反應(yīng)。②異常免疫學(xué)反應(yīng)：通過體外和動物試驗評價其異常免疫反應(yīng)，包括對不同免疫細(xì)胞亞型及相關(guān)細(xì)胞因子的影響。③非預(yù)期分化：包括非靶細(xì)胞分化或非靶部位分化，可利用特定的檢測技術(shù)，在體內(nèi)動物試驗中研究、評估和監(jiān)控臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞非預(yù)期分化的可能性。④致瘤性和促瘤性：目前，普遍認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞“不致瘤”或具有“弱致瘤性”，但不排除對已存在腫瘤的“促瘤性”作用，應(yīng)設(shè)計相應(yīng)的試驗方法，以判斷制劑的“促瘤性”。對高代次或經(jīng)過體外復(fù)雜處理和修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行動物致瘤性和促瘤性評估。可選擇合適的動物實驗?zāi)Ｐ?，使用合適數(shù)量的干細(xì)胞、合理的植入途徑和足夠長的觀察期，以有效評價制劑的致瘤性和促瘤性。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的病原生物安全是指攜帶和傳播細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體、真菌、寄生蟲的風(fēng)險和內(nèi)毒素殘留等。一些常見的病原體，如HBV、HCV、HIV、EBV、CMV、HTLV、梅毒螺旋體、支原體、霉菌、內(nèi)毒素等，已經(jīng)建立了實驗室檢測方法和相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，基本可以滿足臨床要求。隨著新的病原體被發(fā)現(xiàn)，將來會增加新的檢測項目，確保臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑不含任何內(nèi)部的和外源的病原體。

通過制定符合臨床治療要求的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑生產(chǎn)、儲存、運輸?shù)馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，建立標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)量檢測方法和流程，進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量管理，并不斷完善這些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量檢測方法和質(zhì)量管理流程，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑可以達(dá)到臨床治療要求。

迄今，國內(nèi)外大量臨床研究和治療病例表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療是安全的，除極少數(shù)患者輕度腰部酸痛、發(fā)熱、頭昏、頭痛外，無其他任何嚴(yán)重不良反應(yīng)。但是，目前仍有一些患者不宜進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療。這些患者是：晚期惡性腫瘤尤其是腦腫瘤患者;休克或全身衰竭生命體征不正常及不配合檢查者;合并心、肺、肝、腎等重要臟器功能障礙者;全身感染或局部嚴(yán)重感染抗感染康復(fù)前;凝血功能障礙者;血清學(xué)檢查(如艾滋病、乙肝、梅毒等)陽性;高度過敏體質(zhì)或有嚴(yán)重過敏史者；非神經(jīng)系統(tǒng)疾患或尚未明確診斷者；其他不適于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植的人群。