蒟子的化學(xué)成分研究

張潘華，楊 珺，羅吉鳳，夏夢(mèng)媛，龍春林，王 俐，王躍虎*

1中國科學(xué)院昆明植物研究所 資源植物與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及云南省野生資源植物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2中央民族大學(xué) 民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，昆明650201

胡椒科(Piperaceae)胡椒屬(PiperLinn.)植物全球約2000種；中國分布60余種，其中約30種為藥用植物[1,2]。部分胡椒屬植物在民間用于治療癌癥，目前已從胡椒屬植物中發(fā)現(xiàn)具有細(xì)胞毒活性的酰胺、木脂素、鏈烯基苯酚(alkenylphenols)、查爾酮、胡椒內(nèi)酯(piperolides)等類型成分[1]。

蒟子(PiperyunnanenseTseng)，別名大麻疙瘩，產(chǎn)于云南南部、西南部和西北部。生于林中或濕潤地，海拔1 100～2 000 m[2]。蒟子全株入藥，有舒筋活絡(luò)、溫經(jīng)行濕、行氣止痛的功能，用于風(fēng)濕、跌打損傷、胃痛和月經(jīng)不調(diào)等[3]。2012年6月，我們?cè)谠颇鲜∥麟p版納州基諾鄉(xiāng)進(jìn)行了調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)鼗Z族人將蒟子的根搗碎包敷，用于治療跌打損傷；傣族人將蒟子的根泡水，當(dāng)作飲料飲用。但是，至今為止，尚無人報(bào)道該藥用植物的化學(xué)成分。我們對(duì)采集于當(dāng)?shù)氐纳X子全株進(jìn)行化學(xué)成分研究，發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的酰胺成分及6個(gè)已知化合物(圖1)，本文報(bào)道這4個(gè)新化合物的結(jié)構(gòu)解析及其細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果。

1 儀器與材料

旋光由JASCO P-1020旋光儀(Jasco Corp.，Tokyo，Japan)測(cè)定；紫外光譜(UV)由Shimadzu UV-2401 PC紫外分光光度儀(Shimadzu，Kyoto，Japan)測(cè)定；ECD譜由Chirascan圓二色譜儀(Applied Photophysics Ltd.，Leatherhead，UK)測(cè)定；紅外光譜(IR)由Bruker Tensor 27 FTIR紅外光譜儀(Bruker Corp.，Ettlingen，Germany)測(cè)定(KBr壓片)；1H和13C NMR波譜由Bruker DRX-500核磁共振儀(Bruker Bio-Spin GmbH，Rheinstetten，Germany)測(cè)定(TMS為內(nèi)標(biāo))；電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)由API Qstar Pulsar1質(zhì)譜儀(Applied Biosystems/MDS Sciex，F(xiàn)oster City，CA，USA)測(cè)定；高分辨電子轟擊質(zhì)譜(HR-EI-MS)由Waters AutoSpec Premier p776三扇型雙聚焦磁質(zhì)譜儀(Waters，Millford，MA，USA)測(cè)定；柱層析用材料包括正相硅膠G(100～200目、300～400目)、H型硅膠(10～40 μm)和硅膠G245(青島海洋化工廠)，反相硅膠RP-C18(40～75 μm，日本Fuji Silysia 化學(xué)公司)，D101大孔吸附樹脂(青島海洋化工廠)，以及凝膠Sephadax LH-20(GE Healthcare Bio-Sciences AB)?；衔锇胫苽洳捎肁gilent 1200型高效液相色譜(HPLC)儀，配備色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(9.4×250 mm，5 μm)和Waters XBridge prep C18(10×250 mm，5 μm)。化合物顯色劑為5%H2SO4-乙醇溶液。

蒟子全株于2012年6月，采自云南省西雙版納州景洪市基諾鄉(xiāng)，由本文作者龍春林教授和楊珺實(shí)驗(yàn)師鑒定為PiperyunnanenseTseng，標(biāo)本(2012083)保存于中國科學(xué)院昆明植物研究所資源植物與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離

將蒟子的全株(5.7 kg)干燥后粉碎，用甲醇常溫浸漬法提取4次，每次7天。濾液回收溶劑后，得粗提物(410 g)。加入水制備成混懸液，依次用石油醚和氯仿萃取后得到石油醚部分(0.7 g)和氯仿部分(18.0 g)。通過薄層色譜檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，水相還有大量的改良碘化鉍鉀顯色的成分，因此，將水相部分用D101大孔吸附樹脂進(jìn)行柱色譜分離，水洗脫部分棄去，90%乙醇洗脫部分濃縮后得醇洗脫部位(24.1 g)。將醇洗脫部位用正相硅膠柱層析劃段(氯仿-甲醇，5∶1→1∶1，V/V)，最終得到5個(gè)部分(A～E)。

A部分(9.1 g)經(jīng)RP-18反相硅膠柱層析(甲醇-水，5∶95→90∶10)洗脫，取50%甲醇洗脫部分經(jīng)Sephadex LX-20凝膠(甲醇)柱層析，得到4個(gè)組分樣品(A1～A4)。A1經(jīng)正相硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯，3∶1)后，用半制備HPLC(Agilent Zorbax SB-C18柱，流速v=2 mL/min；乙腈-水，39∶61)純化，得到化合物1(tR=29.427 min，3.2 mg)和2(tR=43.065 min，3.4 mg)。A2經(jīng)正相硅膠柱層析(氯仿-丙酮，3∶1和1∶1)后，用半制備HPLC(Agilent Zorbax SB-C18柱，流速v=2 mL/min；乙腈-水，43∶57；tR=22.570 min)純化，得化合物3(8.3 mg)。A3經(jīng)正相硅膠層析(氯仿-乙酸乙酯，5∶1和3∶1)和Sephadex LX-20凝膠柱層析(甲醇)后，用半制備HPLC(Agilent Zorbax SB-C18柱，流速v=2 mL/min；乙腈-水，43∶57；tR=16.570 min)純化，得到化合物4(3.7 mg)。A4經(jīng)正相硅膠(氯仿-乙酸乙酯，5∶1和3∶1)后，用半制備HPLC(Agilent Zorbax SB-C18柱，流速v=2 mL/min；甲醇-水，55∶45)分離，得到化合物10(tR=14.341 min，3.7 mg)、8(tR=20.896 min，3.4 mg)和9(tR=28.876 min，4.2 mg)。

D部分(2.4 g)經(jīng)RP-18反相硅膠柱層析(甲醇-水，5∶95→90∶10)后，取50%甲醇洗脫部分，進(jìn)行Sephadex LX-20凝膠柱(甲醇)和正相硅膠柱(氯仿-甲醇，5∶1)層析，最后經(jīng)過半制備HPLC [Waters XBridge prep C18柱，流速v=2 mL/min；甲醇-水(含0.05%三氟醋酸)，65∶35]分離，得化合物5(tR=15.535 min，10.0 mg)、7(tR=19.828 min，12.2 mg)和6(tR=25.963 min，6.1 mg)。

2.2 細(xì)胞毒活性測(cè)試

細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)采用MTS法，根據(jù)文獻(xiàn)中提供的方法進(jìn)行癌細(xì)胞生長(zhǎng)活性測(cè)試[4,5]。MTS為MTT類似物，全稱為3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)- 2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium。活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTS，生成可溶性的甲臜(formazan)化合物，該化合物的光密度OD(490 nM)值與活細(xì)胞數(shù)目成正比。應(yīng)用兩點(diǎn)法(Reed and Muench法)計(jì)算化合物的IC50值。順鉑和紫杉醇為陽性對(duì)照。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1的核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(500 MHz 和125 MHz，CDCl3，δ in ppm，J in Hz,下同)

圖1 蒟子中化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of compounds 1-10 from P.yunnanense

化合物1的高分辨質(zhì)譜(HR-EI-MS)顯示出[M]+峰m/z566.262 6(calcd for C31H38N2O8，566.262 8)，推斷其分子式為C31H38N2O8，不飽和度14。1H NMR譜(表1)中顯示有4個(gè)甲氧基[δH3.91(3H，s)、3.87(6H，s)和3.80(3H，s)]，1個(gè)亞甲二氧基[δH5.94(1H，d，J= 1.3 Hz)和5.93(1H，d，J= 1.3 Hz)]，以及兩個(gè)四取代苯環(huán)[δH6.66(2H，s)、6.65(d，J= 1.3 Hz)和6.62(d，J= 1.3 Hz)]的信號(hào)。13C NMR譜(表1)顯示該化合物存在2個(gè)酰胺羰基(δC169.4和169.3)，4個(gè)甲氧基，1個(gè)亞甲二氧基，兩個(gè)苯環(huán)，兩個(gè)四氫吡咯片段，以及4個(gè)次甲基(δC49.4、49.2、41.8和41.6)。

通過分析以上波譜特征，并把化合物1的NMR數(shù)據(jù)跟已知化合物(E)-N-(3，4，5-三甲氧基肉桂?；?四氫吡咯[(E)-N-(3,4,5-trimethoxycinnamoyl)pyrrolidine，8][6]和(E)-N-(5-甲氧基-3，4-亞甲二氧基肉桂?；?四氫吡咯[(E)-N-(5-methoxy-3,4-methylenedioxycinnamoyl)pyrrolidine，9][7]的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，推測(cè)化合物1很可能是化合物8與9通過[2+2]光環(huán)合加成的產(chǎn)物。從化合物1的EI-MS譜碎片離子峰(圖2)推測(cè)，該化合物是頭對(duì)尾的[2+2]加成產(chǎn)物。其平面結(jié)構(gòu)通過COSY和HMBC相關(guān)(圖3)得到確認(rèn)。在HMBC譜中，H-2和H-6跟C-7，以及H-7跟C-2和C-6有相關(guān)，說明3，4，5-三甲氧基苯基連接在C-7上；H-2′′和H-6′′跟C-7′′，以及H-7′′跟C-2′′和C-6′′有相關(guān)，說明5-甲氧基-3，4-亞甲二氧基連接在C-7′′上，進(jìn)一步確證了化合物1是頭對(duì)尾的[2+2]加成產(chǎn)物。

圖2 化合物1～4的EI-MS裂解碎片F(xiàn)ig.2 EI-MS fragments of compounds 1-4 注：括號(hào)中為相對(duì)豐度。Note:Relative intensities in brackets.

圖3 化合物1～4關(guān)鍵的2D NMR相關(guān)Fig.3 2D NMR correlations of compounds 1-4

根據(jù)ROESY相關(guān)(圖3)來判斷化合物1的相對(duì)構(gòu)型，H-7與H-8′′跟H-2′′和H-6′′有相關(guān)，表明這些氫原子均位于平面的一側(cè)；而H-8與H-7′′跟H-2和H-6有相關(guān)，表明這些氫原子位于平面的另一側(cè)。這樣，化合物1的相對(duì)構(gòu)型得以確定，命名為蒟子酰胺A(piperinamide A)。由于該化合物的圓二色譜(CD)無信號(hào)，推測(cè)為消旋體。我們嘗試進(jìn)行手性拆分，但沒有成功。

表2 化合物2和4的核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù)

化合物2的高分辨EI質(zhì)譜顯示出[M]+峰m/z550.231 0(calcd for C30H34N2O8，550.231 5)，推斷其分子式為C30H34N2O8，不飽和度15。從分子式來看，該化合物應(yīng)該有30個(gè)碳，但其13C NMR譜(表2)中只能看到15個(gè)信號(hào)(1個(gè)苯環(huán)，1個(gè)甲氧基，1個(gè)亞甲二氧基，1個(gè)羰基，1個(gè)四氫吡咯基，以及2個(gè)高場(chǎng)次甲基)，推測(cè)其具有分子內(nèi)對(duì)稱結(jié)構(gòu)。將該化合物的NMR數(shù)據(jù)(表2)跟化合物1及已知化合物(E)-N-(5-甲氧基-3，4-亞甲二氧基肉桂酰基)四氫吡咯(9)的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，并結(jié)合EI-MS裂解碎片分析(圖2)，推測(cè)化合物2是由兩分子(E)-N-(5-甲氧基-3，4-亞甲二氧基肉桂酰基)四氫吡咯的頭對(duì)尾[2+2]光環(huán)合加成的產(chǎn)物。化合物2的H-7和H-7′′(δH4.57，2H，dd，J= 10.4，7.0 Hz)，以及H-8和H-8′′(δH3.61，2H，dd，J= 10.4，7.0 Hz)的化學(xué)位移及偶合常數(shù)跟1這幾個(gè)氫的數(shù)據(jù)(表1)基本一致，因此，推測(cè)其相對(duì)構(gòu)型跟1的一致。把化合物2命名為蒟子酰胺B(piperunnamide B)。

化合物3的高分辨EI質(zhì)譜顯示出[M]+峰m/z566.262 8(calcd for C31H38N2O8，566.262 8)，推斷其分子式為C31H38N2O8，不飽和度14，其分子式跟蒟子酰胺A(1)完全一樣，是后者的同分異構(gòu)體。跟蒟子酰胺A一樣，化合物3的13C NMR譜(表3)也顯示該化合物存在2個(gè)酰胺羰基(δC170.5和170.4)，4個(gè)甲氧基，1個(gè)亞甲二氧基，兩個(gè)四氫吡咯，以及4個(gè)高場(chǎng)次甲基(δC45.7、45.7、43.9和43.8)。結(jié)合化合物3的EI-MS譜碎片離子峰(圖2)推測(cè)，該化合物是化合物8和9頭對(duì)頭的[2+2]加成產(chǎn)物。HMBC相關(guān)中(圖3)，可以看到H-2和H-6跟C-7，以及H-7跟C-2和C-6的相關(guān)，說明3，4，5-三甲氧基苯基連接在C-7位；H-2′′和H-6′′跟C-7′′，以及H-7′′跟C-2′′和C-6′′的相關(guān)，說明5-甲氧基-3，4-亞甲二氧基連接在C-7′′上，進(jìn)一步確證了化合物3是頭對(duì)頭的[2+2]加成產(chǎn)物。

表3 化合物3的核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù)

根據(jù)ROESY相關(guān)(圖3)可判斷化合物3的相對(duì)構(gòu)型，H-2、H-6、H-8和H-8′′跟H-2′′和H-6′′有相關(guān)，表明這些氫原子均位于平面的一側(cè)；而H-7與H-7′′跟H2-1′和H2-1′′′有相關(guān)，表明這些氫原子位于平面的另一側(cè)。這樣，化合物3的相對(duì)構(gòu)型得以確定，給俗名蒟子酰胺C(piperunnamide C)。

化合物4的高分辨EI質(zhì)譜顯示出[M]+峰m/z550.229 8(calcd for C30H34N2O8，550.231 5)，推斷其分子式為C30H34N2O8，不飽和度15，是化合物2的同分異構(gòu)體。從分子式來看，該化合物應(yīng)該有30個(gè)碳，但其13C NMR譜(表2)中只能看到15個(gè)信號(hào)(1個(gè)苯環(huán)，1個(gè)甲氧基，1個(gè)亞甲二氧基，1個(gè)羰基，1個(gè)四氫吡咯基，以及2個(gè)高場(chǎng)次甲基)，推測(cè)其具有分子內(nèi)對(duì)稱結(jié)構(gòu)。將該化合物的NMR數(shù)據(jù)(表2)跟化合物3及化合物9的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)合EI-MS裂解碎片分析(圖2)，推測(cè)化合物4是兩分子(E)-N-(5-甲氧基-3，4-亞甲二氧基肉桂?；? 四氫吡咯的頭對(duì)頭[2+2]光環(huán)合加成的產(chǎn)物?；衔?的H-7和 H-7′′(δH4.29，2H，m)，C-7和C-7′′(δC45.5)，H-8和H-8′′(δH3.69，2H，m)，以及C-8和C-8′′(δC43.9)的化學(xué)位移跟3這幾個(gè)位置氫和碳的數(shù)據(jù)(表3)基本一致，因此，推測(cè)其相對(duì)構(gòu)型跟3的一致。把化合物4命名為蒟子酰胺D(piperunnamide D)。

通過跟文獻(xiàn)中的化合物對(duì)比波譜數(shù)據(jù)，已知化合物分別鑒定為短蒟酰胺C(pipermullamide C，5)[8]，短蒟酰胺D(pipermullamide D，6)[8]，短蒟酰胺E(pipermullamide E，7)[8]，(E)-N-(3，4，5-三甲氧基肉桂?；?四氫吡咯[(E)-N-(3,4,5-trimethoxycinnamoyl)pyrrolidine，8][6]，(E)-N-(5-甲氧基-3，4-亞甲二氧基肉桂?；?四氫吡咯[(E)-N-(5-methoxy-3,4-methylenedioxycinnamoyl)pyrrolidine，9][7]，以及(Z)-N-(3，4，5-三甲氧基肉桂?；? 四氫吡咯[(Z)-N-(3,4,5-trimethoxycinnamoyl)pyrrolidine，10][9]。

3.2 化合物的物理常數(shù)

蒟子酰胺A(piperunnamide A，1) 白色粉末(CHCl3)；UV(CH3OH)λmax(logε)275(2.81)，240(3.39)，207(4.08)nm；IR(KBr)νmax1 631，1 452，1 383，1 049 cm-1；1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表1；EI-M:m/z(rel.int.)566 [M]+(38)，468(19)，291(100)，275(17)，221(67)，205(47)；ESI-MS:m/z589 [M + Na]+；HR-EI-MSm/z:566.262 6 [M]+(calcd for C31H38N2O8，566.262 8)。

蒟子酰胺B(piperunnamide B，2) 白色粉末(CHCl3)；UV(CH3OH)λmax(logε)276(3.68)，245(4.17)，210(4.87)nm；IR(KBr)νmax1 632，1 511，1 448，1 439，1 383，1 197，1 133，1 093，1 045 cm-1；1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表2；EI-MS:m/z(rel.int.)550 [M]+(68)，305(100)，275(91)，206(80)；ESI-MS:m/z573 [M + Na]+，HR-EI-MS:m/z550.231 9 [M]+(calcd for C30H34N2O8，550.231 5)。

蒟子酰胺C(piperunnamide C，3) 白色粉末(CHCl3)；UV(CH3OH)λmax(logε)274(3.37)，240(4.08)，206(4.88)nm；IR(KBr)νmax1 632，1 511，1 451，1 126，1 094，1 045 cm-1；1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表3；EI-MS:m/z(rel.int.)566 [M]+(15)，344(6)，291(100)，275(16)，222(62)；ESI-MS:m/z589 [M + Na]+，HR-EI-MS:m/z566.262 8 [M]+(calcd for C31H38N2O8，566.262 8)。

蒟子酰胺D(piperunnamide D，4) 白色粉末(CHCl3)；UV(CH3OH)λmax(logε)280(3.49)，244(4.03)，208(4.84)nm；IR(KBr)νmax1 631，1 512，1 451，1 384，1 199，1 131，1 092，1 046 cm-1；1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表2；EI-MS:m/z(rel.int.) 550 [M]+(10)，328(10)，275(88)，223(8)，206(100)；ESI-MS:m/z573 [M + Na]+，HR-EI-MS:m/z550.229 8 [M]+(calcd for C30H34N2O8，550.231 5)。化合物1～4的詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(www.trcw.ac.cn)。

3.3 細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果

測(cè)試了4個(gè)新化合物對(duì)5種腫瘤細(xì)胞株的體外細(xì)胞毒活性，結(jié)果見表4。蒟子酰胺A(1)對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞(IC50=10.99 μM)、人肝癌SMMC-7721細(xì)胞(IC50=17.10 μM)、人肺癌A-549細(xì)胞株(IC50=7.93 μM)、乳腺癌MCF-7細(xì)胞(IC50=16.63 μM)和結(jié)腸癌SW480細(xì)胞(IC50=9.16 μM)的生長(zhǎng)有抑制活性。其余3個(gè)化合物沒有活性(IC50>40 μM)。

在此前的研究中，我們注意到，胡椒屬植物中的酰胺類成分，如果其分子結(jié)構(gòu)中具有3，4，5-三甲氧基苯基片段，該化合物可能會(huì)顯示出較好的細(xì)胞毒活性，比如蓽拔明堿(piperlongumine)[1]。我們也因此合成了一些含有這種結(jié)構(gòu)片段的酰胺類成分[10]?；衔?和3含有3，4，5-三甲氧基苯基片段，化合物2和4沒有這種結(jié)構(gòu)片段?；衔?具有細(xì)胞毒活性，符合上述構(gòu)效關(guān)系(structure-activity relationship)的預(yù)測(cè)；化合物3沒有活性，可能是由于其立體構(gòu)型的差異造成的。

表4 蒟子中化合物1～4對(duì)5株腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

注：每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次；IC50值是根據(jù)3次試驗(yàn)所得抑制率的平均值計(jì)算出來的；順鉑和紫杉醇為陽性對(duì)照。

Note:All experiments were repeated three times;IC50values were calculated from the mean inhibition value at each concentration;Cisplatin and paclitaxel are positive control.

4 結(jié)論

從蒟子全株中分離、鑒定出了10個(gè)化合物，其中4個(gè)為新的酰胺類成分，所有化合物均是首次從該植物中發(fā)現(xiàn)。蒟子酰胺A(1)對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞、人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人肺癌A-549細(xì)胞株、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制活性。為了更好地開發(fā)利用這個(gè)藥用植物，有必要對(duì)其開展更深入的化學(xué)成分研究和藥理活性評(píng)價(jià)。

致謝：在云南省西雙版納州景洪市基諾鄉(xiāng)調(diào)查時(shí)，得到基諾族村民阿妹和周布魯?shù)膸椭?；同時(shí)，劉洪新和譚英也參與了此次調(diào)查，在此一并致謝。