阿里紅多糖組分對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠海馬區(qū)AKT/GSK3β/Tau/P-tau蛋白表達的影響

李 珍，叢媛媛，阿依江·哈拜克，帕麗達·阿不力孜

新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD) 是一種發(fā)生于老年期或老年前期的以進行性認知功能減退為典型表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，同時伴有精神行為異常、人格障礙等臨床癥狀。近年來，對于阿爾茨海默病流行病學(xué)和基因?qū)W的研究，進一步闡明了其致病因素、遺傳的復(fù)雜性以及病理變化[1,2]。AD典型臨床特征主要是神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)和老年斑(senile plaque，SP)，其重要病理變化主要有兩方面：β淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)以及高度磷酸化Tau蛋白共同構(gòu)成的神經(jīng)纖維纏結(jié)NFTs。神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要成分是微管相關(guān)蛋白Tau。AD患者腦中Tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致其與微管結(jié)合能力降低，磷酸化的Tau蛋白聚集形成細胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)，干擾神經(jīng)元的正常功能，并最終導(dǎo)致神經(jīng)元的變性與死亡[3,4]。

阿里紅為多孔菌科大型真菌阿里紅(FomesofficinalisAmes)的子實體，主要分布在我國西北和東北，其中在新疆主要分布于阿勒泰地區(qū)。阿里紅多糖是阿里紅中除三萜酸、甾醇類、黃酮類等之外的又一重要生物活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)及抗衰老活性作用[5]。前期研究已證實，阿里紅多糖在傳統(tǒng)方法構(gòu)建的AD模型中均表現(xiàn)出明顯的拮抗AD作用，具有一定的防治神經(jīng)退行性疾病的作用[6]。阿里紅多糖組分FOPS-a、FOPS-b是經(jīng)過阿里紅粗多糖純化后得到的兩個組分[7]，目前尚未見有關(guān)FOPS-a和FOPS-b抗AD的文獻報道。本試驗擬以FOPS-a、FOPS-b為研究對象，應(yīng)用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠[8,9]，采用跳臺、曠場實驗、尼氏染色法、RT-PCR、Western-blot等實驗手段，從行為學(xué)、組織病理學(xué)、分子生物學(xué)角度初步探討阿里紅多糖組分FOPS-a和FOPS-b對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦部海馬區(qū)AKT/GSK3β/Tau/P-tau蛋白表達的影響，為阿里紅多糖類成分防治AD的作用提供參考數(shù)據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

阿里紅多糖組分FOPS-a與FOPS-b由課題組自制；鹽酸多奈哌齊(批號1704021，衛(wèi)材藥業(yè)有限公司)；Total RNA提取試劑(批號AI21584A，日本TAKARA公司)、熒光定量試劑(批號AJ11523A，日本TAKARA公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑(批號AJ12435A)，日本TAKARA公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號20181218，北京索萊寶有限公司)。20×TBST(批號20190605，北京索萊寶有限公司)；脫脂奶粉(批號EZ3456D330，)；吐溫20(批號308P013， 北京索萊寶有限公司)。AKT兔抗單克隆抗體(批號GR3235334-3，abcam公司)；GSK3β兔抗單克隆抗體(批號GR312697-15，abcam公司)；Tau兔抗單克隆抗體(批號GR64/32-4，abcam公司)；P-tau兔抗單克隆抗體(批號GR303639-20，abcam公司)；HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗(批號 20190321，CST公司)。

1.2 動物

64只APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，雄性，3月齡，體重25±5 g，購買于北京華阜康實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。同月齡同背景的C57BL/6J小鼠8只，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，使用許可證編號：SYXK(新)2016-0002。小鼠全部飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房4-6室，單籠單只飼養(yǎng)，每周換一次墊料和水。室溫20-25℃，濕度40%-60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗，實驗過程中動物自由攝食與飲水。

1.3 儀器

DT-200小鼠跳臺測試儀(成都泰盟科技有限公司)；OFT-100大小鼠開場活動實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；TP-114電子天平(北京Sartorius公司)；勻漿機(上海博訊公司)；低溫冷凍高速離心機(美國Thermo Scientific公司)，全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國thermo公司)；RM2016病理切片機(德國Leica公司)；凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備(美國BIO-RAD公司)；DM4000熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

64只APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為模型組、多奈哌齊組(每日灌胃劑量為0.65 mg/kg)、阿里紅多糖組分(FOPS-a和FOPS-b)高、中、低劑量組(每日灌胃劑量分別為60、30、15 mg/kg)每組8只。8只C57BL/6J小鼠作為正常對照組，模型組和正常對照組給予等體積的生理鹽水灌胃。與3月齡時對各組小鼠實施灌胃治療，每天上午灌胃1次，連續(xù)灌胃90天。

2.2 跳臺行為學(xué)實驗

小鼠跳臺裝置為一個長方形反射箱，大小為 20 cm×20 cm×30 cm，用黑色塑料板分隔成為6間。底面鋪以間距為5 mm可通交流電的銅柵。每間左后放置一高3.2 cm、直徑4.5 cm的絕緣橡膠站臺[10,11]。小鼠位于站臺上可免受電擊，當(dāng)小鼠跳下站臺時，則遭受到 24 V電擊刺激。本實驗連續(xù)進行兩天，第一天為適應(yīng)學(xué)習(xí)階段，首先將小鼠放入跳箱中熟悉周圍環(huán)境自由活動3 min，隨后通24 V的交流電，持續(xù)5 min。小鼠受到電擊后其正常反應(yīng)是跳上站臺以躲避傷害性刺激，多數(shù)動物可能會再次或多次跳至網(wǎng)柵上，受到電擊后又迅速跳回站臺。記錄每只小鼠第一次跳下站臺的時間(即潛伏期)和受到電擊的次數(shù)(即錯誤次數(shù))。第2天為實驗階段，即記憶保持階段。(實驗前無需再適應(yīng))直接將小鼠放置于站臺上，同時通電觀察，記錄小鼠第一次跳下站臺的潛伏期和5 min內(nèi)的錯誤次數(shù)。

2.3 曠場實驗

曠場實驗以實驗動物在新奇的環(huán)境中某些行為學(xué)的發(fā)生頻率和持續(xù)時間為指標(biāo)，反應(yīng)實驗動物在陌生環(huán)境中的自主和探究行為[12,13]。曠場實驗裝置為長50 cm，寬50 cm，高40 cm的實驗箱，箱底部由外向內(nèi)化分為邊緣區(qū)、中間區(qū)、中心區(qū)三部分：邊緣區(qū)距離曠場邊緣8 cm，中心區(qū)占總區(qū)域面積的16%，剩余為中間區(qū)。攝像頭置于中心區(qū)正上方。實驗時將小鼠背靠箱壁投放于固定邊緣區(qū)，實驗人員遠離曠場箱，小鼠自主活動同時進行攝像5 min。記錄小鼠在曠場中的站立次數(shù)(即兩前肢離地1 cm的次數(shù))，水平運動距離。實驗室保持安靜，光線均勻。

2.4 腦組織取材及石蠟包埋

行為學(xué)實驗結(jié)束后，使用10%水合氯醛麻醉小鼠將其固定在泡沫板上。用消毒后鑷子和小剪刀打開胸腔暴露出心臟和肝臟，先用裝有生理鹽水注射器的針頭小心插入小鼠左心室進行灌注，同時去除肝臟使血液流出，待小鼠舌頭變白再用4%多聚甲醛灌流固定完全后迅速取出全腦。在冰袋上分離左右腦，一半腦浸在甲醛固定液中，一半腦分離出海馬放入凍存管中，液氮迅速冷凍后移入-80℃冰箱凍存，用于Western blot等分子生物學(xué)指標(biāo)檢測。石蠟包埋前取出固定液中腦組織，用刀片剔除海馬區(qū)周圍多余組織，制作厚度為0.5 cm的海馬冠狀切片放入包埋盒。流水清洗30 min→蒸餾水清洗3遍(每遍3-5 min)→75%乙醇浸泡(過夜)→95%乙醇Ⅰ(1 h)→95%乙醇Ⅱ(1 h)→無水乙醇Ⅰ(1 h)→無水乙醇Ⅱ(1 h)→二甲苯透明液Ⅰ(15 min)→二甲苯透明液Ⅱ(15 min)→浸蠟Ⅰ(1 h)→浸蠟Ⅱ(1 h)。包埋后連續(xù)在海馬冠狀區(qū)切片。切下的薄片容易皺折，需放到熱水中燙平后再貼到載玻片上，置于45 ℃恒溫箱中烘干，常溫保存，用于病理學(xué)檢測。

2.5 尼氏染色

尼氏染色前需將選取的每組切片脫蠟。于45 ℃烘箱干燥1 h后，將切片放入二甲苯脫去切片中石蠟，再經(jīng)由無水乙醇(5 s)→95%乙醇Ⅰ(5 s)→95%乙醇Ⅱ(5 s)→80%乙醇(5 s)→蒸餾水清洗(3～5次)，使用尼氏染色試劑盒染色，染色后的切片由無水乙醇脫水后，再經(jīng)二甲苯透明滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片封固，置光鏡下觀察[14]。

2.6 RT-PCR分析mRNA表達

自-80 ℃冰箱中取出海馬組織塊，置經(jīng)冰預(yù)冷的研缽中。按0.1 g∶1 mL 比例加入Trizol溶液，迅速研磨，將海馬粉末加入無菌的1.5 mL離心管中按試劑盒說明書操作提取。酶標(biāo)儀測定經(jīng)稀釋的RNA提取物的A值和濃度、RNA的體外反轉(zhuǎn)與RT-PCR。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，擴增40個循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參[15]。

表1 引物序列

2.7 Western-blot法檢測小鼠海馬區(qū)AKT、GSK3β、Tau、P-tau蛋白表達

用鑷子取出凍存管中海馬組織并移入預(yù)冷研缽里，迅速倒入少許液氮冷凍組織成塊，按1∶5比例加入混合裂解液(RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑)快速研磨組織，期間可加入2～3次液氮，保證低溫環(huán)境。直至組織全部融于裂解液中，從研缽中吸取研磨混合液至1.5 mL EP管，放入冰盒靜置15 min，使組織充分裂解。4 ℃ 12 000 rpm低溫離心30 min，取上清液按照BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白提取含量[16-18]。根據(jù)蛋白濃度按照1∶4比例加入4×上樣緩沖液(loading buffer)，加入水補充至終體積，混勻后煮蛋白(100 ℃，10 min)。冷卻室溫后放置-20 ℃冰箱保存。檢測時，經(jīng)SDS-PAGE凝膠試劑盒制膠→上樣→加入電泳液(4塊膠電泳液加滿電泳槽，2塊膠可加1/2電泳液)→放置冰盒中電泳(濃縮膠80 V，30 min，分離膠120 V，90 min)→轉(zhuǎn)膜(300 mA，70 min)→1×TBST(洗膜液)10 min，3次→脫脂牛奶封閉(2 h)→1×TBST(洗膜液)10 min，3次→一抗孵育(于4 ℃冰箱搖床上，過夜)→1×TBST(洗膜液)10 min，3次→二抗孵育(2 h)→1×TBST(洗膜液)10 min，3次→滴加顯色液→曝光(凝膠成像分析系統(tǒng)掃描)，用Image J軟件定量分析目的蛋白條帶，進行灰度分析[16]。結(jié)果以(目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值)×100%表示。其中AKT、GSK3β、Tau、P-tau、β-actin抗體稀釋濃度分別為1∶10 000、1∶5 000、1∶8 000、1∶8 000、1∶5 000，二抗稀釋濃度為1∶5 000。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

3 實驗結(jié)果

3.1 跳臺行為學(xué)實驗結(jié)果

各組小鼠跳臺實驗潛伏期和錯誤次數(shù)比較結(jié)果如表2所示，與模型組相比，F(xiàn)OPS-a高、中劑量組和FOPS-b高劑量組小鼠的反應(yīng)期明顯縮短，潛伏期明顯延長，錯誤次數(shù)明顯減少，有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；FOPS-b中(30 mg/kg)劑量組反應(yīng)期縮短，潛伏期延長，錯誤次數(shù)減少有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示FOPS-a與FOPS-b組分對AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用。

表2 FOPS-a與FOPS-b對跳臺實驗結(jié)果的影響

注：與正常組比較，##P<0.01，#P<0.05；與模型組比較**P<0.01，*P<0.05。

Note:Compared with normal,##P<0.01,#P<0.05;Compared with model,**P<0.01,*P<0.05.

3.2 曠場實驗檢測結(jié)果

由表3可知，與正常組比較，模型組水平運動距離與站立次數(shù)顯著減少(P<0.01)；與模型組小鼠相比，F(xiàn)OPS-a與FOPS-b高(60 mg/kg)、中(30 mg/kg)劑量組水平運動距離和站立次數(shù)明顯增多，有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，低劑量組(15 mg/kg)有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。表明FOPS-a與FOPS-b能夠提高小鼠的運動及空間探索能力，并具有一定的劑量依賴性。

表3 FOPS-a與FOPS-b對曠場實驗的影響

注：與對照組比較，##P<0.01，#P<0.05；與模型組比較**P<0.01，*P<0.05。

Note：Compared with normal,##P<0.01,#P<0.05;Compared with model,**P<0.01,*P<0.05.

3.3 尼氏染色實驗結(jié)果

尼氏染色結(jié)果可見正常組的神經(jīng)元數(shù)目較多，排列緊湊有序，細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)中尼氏體豐富、細胞核淡藍色，背景略呈淺藍色，核仁清晰可見。模型組小鼠神經(jīng)元水腫，細胞數(shù)量明顯減少，細胞間隙增大，排列稀疏且分布紊亂、松散，無明顯層次，細胞體積減小萎縮，胞漿內(nèi)尼氏體減少，分界不清，核固縮，使得著色加深。與模型組相比較，多奈哌齊組、FOPS-a與FOPS-b藥物高、中、低各劑量組的小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)有不同程度的改善，神經(jīng)元水腫減輕，細胞數(shù)量相對增多，排量較為整齊，分界清晰。

圖1 組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元尼氏染色(×20.0)Fig.1 Nissl staining of hippocampus in each group of mice(×20.0)注：A正常組，B模型組，C多奈哌齊組，D阿里紅多糖a組分高劑量組，E阿里紅多糖a組分中劑量組，F(xiàn)阿里紅多糖a組分低劑量組，G阿里紅多糖b組分高劑量組，H阿里紅多糖b組分中劑量組，I阿里紅多糖b組分低劑量組。下同。Note:A is normal,B is model,C is Donepezil,D is FOPS-a-H,E is FOPS-a-M,F is FOPS-a-L,G is FOPS-b-H,H is FOPS-b-M,I is FOPS-b-L,the same below.

3.4 RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR法檢測小鼠海馬區(qū)相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果表明，與對照組比較，模型組GSK3β、Tau mRNA表達均升高(P<0.01)，AKT mRNA表達降低(P<0.01)；與模型組相比，多奈哌齊劑量組、FOPS-a與FOPS-b高(60 mg/kg)劑量組GSK3β、Tau mRNA的表達量均降低(P<0.01，P<0.05)，AKT mRNA表達量升高(P<0.01，P<0.05)； 結(jié)果表明FOPS-a與FOPS-b可提高AKT的表達量并抑制GSK3β、Tau mRNA的表達。

表4 FOPS-a與FOPS-b對海馬區(qū)AKT、GSK3β、Tau mRNA表達的影響

注：與對照組比較，##P<0.01，#P<0.05；與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。

Note:Compared with normal,##P<0.01,#P<0.05;Compared with model,**P<0.01,*P<0.05.

3.5 Western-blot檢測結(jié)果

Western-blot法檢測結(jié)果表明，與對照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)GSK3β、Tau、P-tau蛋白的表達量均上調(diào)(P<0.01)，AKT蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，F(xiàn)OPS-a與FOPS-b高(60 mg/kg)、中(30 mg/kg)劑量組小鼠海馬GSK3β、Tau、P-tau蛋白的表達量均明顯下調(diào)(P<0.01)，AKT蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.01)。提示FOPS-a與FOPS-b能夠提高上游蛋白AKT的表達量，阻礙下游GSK3β、Tau、P-tau蛋白的表達，拮抗AD的發(fā)展。

4 討論

AD是一種以智力緩慢進行性喪失為特征的神經(jīng)退行性疾病，是發(fā)生在中樞神經(jīng)的一種病因復(fù)雜的原發(fā)性疾病。主要臨床表現(xiàn)為認知功能障礙和記憶功能減退。由于 AD 的發(fā)病機制較復(fù)雜，研究者形成了眾多不同的假說，其中Aβ淀粉樣學(xué)說和Tau蛋白學(xué)說是目前比較公認的AD發(fā)病機制[19]。而 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠模型是經(jīng)典的 AD 轉(zhuǎn)基因動物模型之一，能夠較好的模擬AD患者早期病理和行為特征[20]。

本研究觀察了FOPS-a與FOPS-b對 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶改善作用。在實驗中，對小鼠認知功能的評估，我們采取了跳臺實驗和曠場實驗。跳臺實驗是一種抑制性被動回避實驗，在記憶研究中，動物模型最重要的特點是抑制模仿活動或?qū)W習(xí)習(xí)慣。被動回避實驗通過動物學(xué)會去掉某種特定的行為而逃避某種厭惡的事情。跳臺實驗中，轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠第一次穿越原平臺的時間較野生型小鼠明顯延長(P<0.05)，而穿越平臺次數(shù)比野生型小鼠明顯減少(P<0.01)，F(xiàn)OPS-a與FOPS-b高、中(60和30 mg/kg)劑量組與模型組相比，學(xué)習(xí)與記憶成績有不同程度提高。由于嚙齒類動物具體有趨觸性，指小鼠畏懼開闊、未知、可能存在潛在危險的場所，因而行為表現(xiàn)出“貼墻”活動的特性。曠場測試結(jié)果表明，模型組小鼠自主活動以四角和邊緣探索為主，而FOPS-a與FOPS-b高劑量組較模型組相比，表現(xiàn)為多以向中心探索為主。

海馬是研究人類和動物學(xué)習(xí)記憶功能的重要腦區(qū)，AD患者的主要臨床癥狀是陳述性記憶受損，這與患者海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)。尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)，在正常的生理情況下，尼氏體大而多，在神經(jīng)細胞中合成蛋白的功能較強，在病理情況下，由于神經(jīng)元的損傷，尼氏體數(shù)量減少甚至消失。尼氏染色結(jié)果表明，模型組小鼠的神經(jīng)細胞受損嚴重，甚至變形萎縮。FOPS-a與FOPS-b不同劑量組相比于模型組對抑制神經(jīng)元損傷有不同程度的改善作用。

Tau及P-tau蛋白是目前了解AD發(fā)病機制的熱點靶標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn)與P-tau的形成最為相關(guān)的是參與調(diào)節(jié)Tau蛋白異常磷酸化的激酶：糖原合成激酶3β(GSK-3β)。其異常激活會導(dǎo)致 Tau 蛋白過度磷酸化[21,22]。AKT蛋白是參與調(diào)控GSK3β的活性的主要蛋白，當(dāng)AKT蛋白合成障礙時，對GSK3β抑制作用下降，GSK3β失去控制被激活促使Tau蛋白異常磷酸化聚集成螺旋絲最終形成纖維纏結(jié)。RT-PCR與Western-blot法檢測AKT、GSK3β、Tau、P-tau蛋白的結(jié)果表明：FOPS-a與FOPS-b能明顯下調(diào)GSK3β、Tau、P-tau的表達量，上調(diào)AKT蛋白表達，通過減少神經(jīng)元的受損，拮抗AD的發(fā)展過程。

圖2 FOPS-a與FOPS-b對海馬區(qū)AKT、GSK3β、Tau、P-tau蛋白表達的影響Fig.2 Effects of FOP component on expression of AKT、GSK3β、Tau、P-tau protein in hippocampus注：與對照組比較，##P<0.01，#P<0.05；與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05；a和e是AKT的蛋白表達，b和f是GSK3β蛋白的表達，c和g是Tau蛋白的表達，d和h是P-tau蛋白的表達。Note:Compared with normal,##P<0.01,#P<0.05;Compared with model,**P<0.01,*P<0.05;a and e are AKT protein expressions,b and f are GSK3β protein expressions,c and g are Tau protein expressions,d and h are P-tau protein expressions.

綜上所述，經(jīng)阿里紅多糖組分(FOPS-a、FOPS-b)干預(yù)后，能有效改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)與記憶障礙，降低Tau蛋白的磷酸化，減少神經(jīng)原纖維纏結(jié)，其機制可能是與抑制GSK3β信號通路相關(guān)蛋白表達有關(guān)。