新型格爾德霉素葡萄糖苷的制備及其誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的作用

李紅梅，李 靜，霍 強，金 勇，吳成柱

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害女性健康和生命[1-2]，向臨床提供安全、有效的抗腫瘤藥物是當(dāng)今醫(yī)藥工作者的使命。熱休克蛋白90(heat shock protein,Hsp90)在腫瘤細胞中的表達比正常細胞高2～10倍，并可調(diào)控眾多信號蛋白的構(gòu)象成熟和穩(wěn)定性，在腫瘤細胞生長、分化、凋亡等方面發(fā)揮重要作用，已成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點之一[3-5]。格爾德霉素(geldanamycin,GA)是第一個鑒定出的Hsp90抑制劑，雖然其抗腫瘤活性很強，但是由于具有肝毒性強、水溶性差等缺點，嚴(yán)重限制了臨床上的應(yīng)用[6-7]。糖基化修飾是提高化合物水溶性的最常用方法之一，不僅可以增加化合物的水溶性和穩(wěn)定性，豐富結(jié)構(gòu)多樣性，并可改善藥物在體內(nèi)的藥代動力學(xué)性質(zhì)，有利于藥物的藥效發(fā)揮[8]。最近，本課題組通過體外酶法糖基化反應(yīng)制備了若干個GA衍生物糖基化產(chǎn)物，但是對低毒性的非苯醌GA衍生物17-demethoxy-reblastatin(17-DR)糖基化產(chǎn)物的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)及其抗腫瘤活性未進行研究報道[9-10]。因此，本研究中將通過體外酶法糖基化法制備新型非苯醌GA糖基化衍生物，并利用ESI-MS和NMR波譜解析鑒定其結(jié)構(gòu)，同時探討和闡明新型非苯醌GA糖基化衍生物對Hsp90活性、人乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡的影響，為今后的持續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 17-DR分子式為C28H42N2O7，由本課題組從StreptomyceshygroscopicusJCM- 4427菌株中提取分離得到，并經(jīng)NMR數(shù)據(jù)分析并與文獻[11]比較確認(rèn)。DMEM培養(yǎng)基和胰酶購于Gibco公司；胎牛血清購于浙江四季青公司；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、UDP-glucose(UDP-Glc)購自Sigma-Aldrich公司；碘化丙啶(PI)購買于 BD Bioscience公司；乙腈(色譜純)購自Thermo Fisher公司；Akt抗體購于Cell signaling公司；Akt抗體購自Proteintech公司；Bcl抗體Hsp90α抗體購于Stressgen公司；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析級。

1.2 細胞及其培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細胞購于中科院上海細胞庫。MCF-7細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清、1×105IU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并用0.25%胰酶消化后傳代培養(yǎng)。

1.3 體外酶法糖基化反應(yīng) 根據(jù)前期研究基礎(chǔ)[9-10,12]，本研究中采用的體外酶法糖基化反應(yīng)條件為：100 mL的 Tris-HCl反應(yīng)緩沖液(100 mmol/L,pH 8.0)，其中包括1 mmol/L的MgCl2，50 μg/L的YjiC蛋白(糖基轉(zhuǎn)移酶)，1 mmol/L 的UDP-Glc，1 mmol/L的底物(17-DR)，在30 ℃反應(yīng)14 h。待反應(yīng)結(jié)束后，于100 ℃沸水中煮沸10 min停止反應(yīng)，并進行分析與精制。取適量的糖基化反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜儀(Waters 2535Q，美國Waters公司)分析色譜條件為SunFireTMC18(4.6 mm×150 mm)色譜柱，梯度洗脫(0～20 min，20%～100%乙腈；20～30 min，100%乙腈)，流速為1 mL/min。糖基化反應(yīng)液經(jīng)Waters 2535Q半制備高效液相色譜進行精制，其色譜條件為SunFireTMC18(10 mm×250 mm)色譜柱，流動相(溶劑A為乙腈；溶劑B為水)，等度洗脫(0～30 min，10%溶劑A)，流速為3 mL/min，檢測波長為254 nm，獲得化合物1(11.5 mg)。

1.4 體外檢測Hsp90 ATPase活性實驗 將2 μmol/L的酵母Hsp90-his融合蛋白置于96孔板中，每孔加入不同濃度的化合物及Tris-HCl反應(yīng)緩沖液(100 mmol/L的Tris-HCl；20 mmol/L的KCl；6 mmol/L的MgCl2；pH 7.4)，混均勻后置37 ℃反應(yīng)2.5 h。待反應(yīng)結(jié)束后每孔加入80 μL的malachite green-molybda溶液顯色，并用酶標(biāo)儀620 nm檢測吸光度(A)，并計算出各化合物抑制Hsp90 ATPase活性的IC50值。以上實驗重復(fù)3次[11,13]。

1.5 MTT法 將處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞接種于96孔板中，每孔細胞數(shù)量為6×103，并置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的17-DR(0、2.5、5、10、20、40、80、100 μmol/L)和化合物1(0、5、10、25、50、100、200、400 μmol/L)后 24、48、72 h后終止培養(yǎng)。每孔加入15 μL的MTT溶液在37 ℃孵育4 h，除去培養(yǎng)液，并加入DMSO 100 μL孵育10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測每孔的A值，并計算細胞存活率。以上實驗重復(fù)3次。

1.6 PI單染/流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將處于對數(shù)生長的MCF-7細胞按每孔1×105的密度接種于6孔板貼壁過夜后，按不同濃度化合物1(0、50、100、200 μmol/L)處理24 h后收集細胞，洗滌。用適量0.9%氯化鈉溶液重懸細胞，加入30 μg/mL PI染色15 min，洗滌，再經(jīng)300 μL 0.9%氯化鈉溶液重懸細胞，上流式細胞儀(Becton Dickinson C6)進行檢測。檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)，計算總數(shù)6000個細胞。

1.7 免疫印跡法檢測蛋白表達 將MCF-7細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板3×105/孔，培養(yǎng)24 h后給予不同濃度的化合物1(0、50、100、200 μmol/L)。冰PBS 清洗后，濾紙吸干液體后加入細胞裂解液，每孔200 μL，置冰上30 min，刮下細胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)置于-80 ℃凍存，經(jīng)3 次反復(fù)凍融后用BCA 蛋白定量法測各組蛋白濃度，調(diào)蛋白濃度后加上樣緩沖液，煮沸5 min變性。每組取蛋白40 μg，經(jīng)SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，封閉過夜后，置相關(guān)蛋白的一抗(Akt、Bcl-2、Hsp90α)、二抗，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光、顯影、定影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 糖基化產(chǎn)物的HPLC分析 HPLC分析結(jié)果(見圖1)顯示，非苯醌GA衍生物17-DR的體外酶法糖基化反應(yīng)液中可觀察到其糖基化產(chǎn)物峰的存在。17-DR峰(底物)的保留時間(tR)為8.8 min，與此對應(yīng)的糖基化產(chǎn)物峰tR為7.2 min。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1為白色粉末，其分子式為C34H52N2O12，ESI-MS [M-H]-m/z679；1H-NMR(700 MHz,DMSO-d6)數(shù)據(jù)為：δH 9.45(-NH,s),7.0(1H,brd,H-19),6.54 (1H,s,H-17),6.49 (1H,s,H-21),5.80 (1H,brs,H-3),5.27 (1H,d,J=9.1 Hz),4.85 (1H,d,J=7.7 Hz,H-7),4.74 (1H,d,J=7.0 Hz,H-1′),3.69 (1H,d,J=10.5 Hz,H-6′),3.50 (1H,dd,J=5.6,10.5 Hz,H-6′),3.32 (3H,s,6-OCH3),3.22 (3H,s,12-OCH3),3.20 (1H,m,H-11),3.18-3.25 (overlap,H-6,H-3′,H-4′,and H-5′),3.0 (2H,m,H-12 and H-2′),2.34-2.60 (overlap,H-13 and H-15),2.33 (1H,m,H-10 ),2.14 (2H,m,H-4 ),1.75 (1H,m,H-14 ),1.71 (3H,s,H-22),1.39 (3H,s,H-23),1.23 (2H,m,H-5 ),0.90 (3H,d,J=6.3 Hz,H-24),0.78 (3H,d,J=5.6 Hz,H-25)；13C-NMR (175 MHz,DMSO-d6) 數(shù)據(jù)為：δC 170.7(C-1),157.6 (C-18),156.1 (7-OCONH2),141.5 (C-16),139.9 (C-20),134.7 (C-3),133.3 (C-9),131.9 (C-2),129.8 (C-8),117.0 (C-21),112.9 (C-17),106.7 (C-19),100.7 (C-1′),80.7 (C-7,C-12,and C-2′),79.4 (C-6),77.1 (C-5′),76.7 (C-3′),73.2 (C-11),69.6 (C-4′),60.6 (C-6′),58.3 (6-OCH3),56.4 (12-OCH3),42.7 (C-13 and C-15),33.9 (C-10),30.9 (C-14),29.7 (C-5),23.4 (C-4),19.1 (C-25),16.3 (C-24),13.1 (C-22),11.8 (C-23)?；衔?除了具有17-DR類似的波譜特征之外，還具有1分子葡萄糖單元信號[δH 4.74 (H-1′),3.0 (H-2′),3.18-3.25 (H-3′,H-4′,H-5′ ),3.69 (H-6′),3.50 (H-6′),和δC 100.7 (C-1′),80.7 (C-2′),76.7 (C-3′),69.6 (C-4′),77.1 (C-5′),60.6 (C-6′)][11]。進一步，根據(jù)HMBC確認(rèn)了化合物1中的糖分子、甲氧基、7-氨基甲?；戎饕倌軋F的連接位置(H-1′/C-18,6-OCH3/C-6,12-OCH3/C-12,H-7/C-6,7-OCONH2,C-8等)(見圖2)。因此，新化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定為17-demethoxy-reblastatin-18-O-β-D-glucopyranoside。

2.3 化合物1對Hsp90 ATPase活性的影響 本研究通過體外酶法糖基化反應(yīng)制備了化合物1，并發(fā)現(xiàn)化合物1具有較強的特異性地抑制酵母Hsp90蛋白ATPase活性。結(jié)果顯示，化合物1顯著地抑制Hsp90活性，其IC50值為8.98 μmol/L，而經(jīng)典的Hsp90抑制劑GA的IC50值為3.06 μmol/L (見表1)。

表1 化合物1抑制Hsp90 ATPase活性

q檢驗：與化合物1比較**P<0.01；與17-DR比較△△P<0.01

2.4 化合物1對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響 結(jié)果表明，化合物1具有一定的抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖的作用，并呈現(xiàn)時間與濃度依賴性，作用于MCF-7細胞72 h的IC50值為81.84 μmol/L (見圖3)。

2.5 化合物1對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響 PI染色/流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，化合物1具有一定的誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡的能力，并呈現(xiàn)濃度依賴性，不同濃度化合物1(50、100、200 μmol/L)其誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡率分別為5.4%、6.1%、14.3%，用200 μmol/L的化合物1處理細胞組誘導(dǎo)細胞凋亡與陰性對照組2.4%比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) (見圖4)。

2.6 化合物1對乳腺癌MCF-7細胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達的影響 結(jié)果顯示，Hsp90顧客蛋白Akt和Bcl-2隨著化合物濃度的增加，其表達逐漸下調(diào)，呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，而對Hsp90蛋白表達基本不產(chǎn)生影響 (見圖5)。與陰性對照組相比，不同濃度的化合物1誘導(dǎo)Akt和Bcl-2蛋白下調(diào)率分別為5%、20%、51%和10%、29%、51%(見表2)。

化合物/(μmol/L)AktBcl-2Hsp90 0 1.00±0.021.00±0.151.00±0.11 50 0.95±0.030.90±0.010.86±0.04?100 0.80±0.03?0.71±0.05?0.88±0.03?200 0.49±0.07??0.49±0.04??0.87±0.04? F 25.20 15.817.09 P<0.01 <0.01<0.05 MS組內(nèi) 0.005 0.008 0.010

與0 μmol/L組比較**P<0.01或*P<0.05

3 討論

伴侶蛋白Hsp90在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起重要作用，Hsp90的顧客蛋白包括酪氨酸激酶受體(EGFR、Her-2)、亞穩(wěn)信號蛋白(Akt、Raf-1)、突變信號蛋白( v-Src、p53)、轉(zhuǎn)綠因子(HIF-1α)等，這些顧客蛋白均是當(dāng)前抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)與開發(fā)的靶點[14]。目前已有多個Hsp90抑制劑進入了治療乳腺癌臨床試驗階段，并表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，如17-AAG、PF-4942947、PU-71等。GA作為Hsp90抑制劑的典型代表，具有很強的抗癌活性，但由于其水溶性差、肝毒性強等缺點，使其在臨床應(yīng)用上受到了限制[7]。尋求水溶性更好、不良反應(yīng)更低的GA衍生物成為了GA系列抗癌新藥研發(fā)的主要方向之一。因此，本研究以低肝毒性的17-DR為底物，通過體外酶法糖基化反應(yīng)進行結(jié)構(gòu)修飾，制備出了水溶性的新型非苯醌GA糖基化衍生物(1)，為今后的GA系列抗腫瘤藥物研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

天然藥物具有結(jié)構(gòu)獨特、多樣、低毒性等優(yōu)點，亦是新藥研發(fā)中先導(dǎo)化合物的重要來源之一。然而，某些天然產(chǎn)物因水溶性低、穩(wěn)定性差等原因，極大地限制了其臨床應(yīng)用。研究[8,15]表明，糖基化結(jié)構(gòu)修飾可增強化合物的穩(wěn)定性，提高水溶性和靶向性，并改善活性和藥代動力學(xué)性質(zhì)。體外酶法糖基化法不僅操作簡單、方便，有效地控制反應(yīng)條件，并且可以精確地檢測反應(yīng)產(chǎn)物。本研究中使用的來源于BacilluslicheniformisDSM-13的糖基轉(zhuǎn)移酶，具有廣泛的底物選擇特異性，可通過酚羥基或醇羥基將糖供體(NDP-sugar)上的糖分子連接至不同結(jié)構(gòu)的底物[9-10,12,16]。本研究為鑒定化合物1 的化學(xué)結(jié)構(gòu)，利用1D-NMR和2D-NMR解析確定了基本骨架、糖分子與苷元，其他主要官能團(甲氧基、氨甲?；?的連接位置。特別是通過糖分子端基質(zhì)子信號的耦合常數(shù)(J=7.0 Hz)，確認(rèn)了化合物1的葡萄糖苷鍵以β構(gòu)型存在。

化合物1以Hsp90為靶點，同時作用于多條信號通路，比作用于單一信號通路的藥物在抗腫瘤活性方面可具有一定的優(yōu)勢?；衔?作為GA衍生物，我們推測其可通過和ATP競爭性地與Hsp90的N-末端結(jié)合，繼而通過泛素化蛋白酶途徑降解其顧客蛋白。生物活性結(jié)果顯示，化合物1抑制Hsp90 ATPase活性、MCF-7細胞增殖的作用，雖然活性強度與底物比較有所下降，這與GA系列糖基化修飾可降低體外活性的一些報道相吻合[17]。同時，化合物1具有誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡的作用，其可能機制是通過下調(diào)Hsp90顧客蛋白Akt和Bcl-2相關(guān)。有趣的是，不同濃度的化合物1對腫瘤細胞內(nèi)Hsp90蛋白表達均沒有影響，表明其抑制Hsp90活性只是抑制Hsp90 ATPase活性來抑制Hsp90伴侶功能，與以往的文獻[13,18]報道一致。

綜上所述，化合物1作為新型結(jié)構(gòu)的非苯醌GA糖基化衍生物，具有抑制Hsp90活性、抗增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，有一定的應(yīng)用前景。然而，本研究只探討了化合物1的體外抗乳腺癌作用，體內(nèi)抗乳腺癌作用及其機制尚有待進一步于深入研究。