龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長作用研究

馬卉 張潤田 1 李 航 黃敏 陳廣山 劉洋 曲天歌 包海蘭 周琳 趙艷 段行武 李玲玲

摘要 目的：研究不同濃度龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、凋亡、遷移能力的影響以及對Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響。方法：1）不同濃度龍血素A作用于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，用CellTiter-Blue活力檢測試驗(yàn)檢測龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響。2）流式細(xì)胞術(shù)檢測龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響。3）劃痕實(shí)驗(yàn)檢測龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移的影響。4）Western-Blot測定龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白水平的影響。結(jié)果：龍血素A可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、遷移并誘導(dǎo)其凋亡，同時減少COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表達(dá)，并促進(jìn)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，并且均呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)論：龍血素A可以調(diào)控瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的平衡、減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而可能對KD發(fā)揮一定的治療作用。

關(guān)鍵詞 龍血素A;瘢痕疙瘩;成纖維細(xì)胞

Study on the Effects of Loureirin A on Keloid Fibroblast Growth Function

MA Hui1，ZHANG Runtian1，LI Hang2，HUANG Min1，CHEN Guangshan1，LIU Yang3，QU Tiange4，BAO Hailan5，ZHOU Lin1，ZHAO Yan1，DUAN Xingwu1，LI Lingling1

（1 Department of Dermatology，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，100700，China; 2 Department of Dermatology，Peking University First Hospital，Beijing，100034，China; 3 Beijing? Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100038，China; 4 Dongfang Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 5 Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region，Hohhot 010017，China）

Abstract Objective：To study the effects of different concentrations of Loureirin A on the proliferation，apoptosis and migration of keloid fibroblasts and the protein expression levels of Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3. Methods：1） Different concentrations of L-Auxin A act on keloid fibroblasts. CellTiter-Blue vitality test was used to test the effects of L-Auxin A on keloid fibroblast proliferation. 2） Flow cytometry was used to detect the effects of L-Auxin A on keloid fibroblasts apoptosis. 3） Scratch test was used to detect the effects of borneol A on keloid fibroblast migration. 4） Proteins expression levels of Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3 were detected by Western-Blot. Results：Loureirin A can inhibit the proliferation and migration of keloid fibroblasts，and induce their apoptosis，reduce the protein expression of Col-I、Col-III、α-SMA and promote the protein expression of Bax and caspase-3，and there is a dosage dependent relationship. Conclusion：Loureirin A can regulate the balance of keloid fibroblast proliferation and apoptosis，reduce the deposition of extracellular matrix，so it may play a certain therapeutic effects on keloid.

Keywords Loureirin A; Keloid; Fibroblast

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.003

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較若滿足正態(tài)性及方差齊時，采用單因素方差分析;不滿足時采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響? 不同濃度龍血素A作用于瘢痕成纖維細(xì)胞后，與對照組比較，抑制率隨濃度升高而升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），且各個濃度在48 h的抑制率均最高。考慮龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的抑制作用具有濃度依賴性，且48 h為藥物的最佳作用時間。見表2。

2.2 龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響? 與對照組比較，龍血素A作用于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞48 h后，隨著給藥劑量的增加，活細(xì)胞數(shù)量明顯降低，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。表明龍血素A能明顯誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡，且具有一定的濃度依賴性。見表2，圖1。

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移的影響 不同濃度龍血素A作用于瘢痕成纖維細(xì)胞48 h后，劃痕寬度明顯大于對照組，且給藥濃度越大劃痕越寬;與對照組比較，50 μg/mL、30 μg/mL、10 μg/mL濃度刺激時劃痕收縮寬度的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。說明龍血素A以濃度依賴性抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的遷移。見表3，圖2。

2.4 龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞COL-I、COL-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，給藥48 h后，龍血素A可下調(diào)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表達(dá)，并上調(diào)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，且隨濃度的增加對三者的調(diào)控作用增強(qiáng)，50 μg/mL、30 μg/mL濃度刺激時，上述目標(biāo)蛋白表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明龍血素A以濃度依賴性抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表達(dá)，同時促進(jìn)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。見表4，圖3。

3 討論

瘢痕疙瘩作為一種難治性皮膚病，常伴有瘙癢疼痛等癥狀，其損容性傷害給患者生命質(zhì)量和心理健康也造成極大負(fù)面影響。發(fā)病機(jī)制方面，F(xiàn)b是參與KD形成的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，它可以分泌ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型膠原以及α-平滑肌肌動蛋白（α-Smooth Muscle Actin，α-SMA），從而形成KD的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)Fb過度增殖或凋亡抑制時，大量膠原蛋白沉積且膠原蛋白之間進(jìn)行病理性交聯(lián)，使ECM發(fā)生沉積和重構(gòu)，從而形成KD[1]。因此，調(diào)控Fb增殖與凋亡的平衡對于抑制KD的形成至關(guān)重要。在線粒體通路的細(xì)胞凋亡中，Bax占優(yōu)勢時細(xì)胞則發(fā)生凋亡[7]，Caspase-3蛋白是細(xì)胞另一重要的促凋亡分子，也是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志[8]，既往如何抑制Fb增殖及膠原形成，通過上調(diào)Bax、Caspase-3等促凋亡因子表達(dá)以誘導(dǎo)其凋亡是研究的核心熱點(diǎn)[9]。

目前其臨床治療主要包括手術(shù)療法，放射、激光等物理療法以及糖皮質(zhì)激素等藥物治療[10]，但都具有一定的不良反應(yīng)且易復(fù)發(fā)、難以根治，因此尋求新型、高效、低毒的抗KD新藥物迫在眉睫。中醫(yī)認(rèn)為KD的關(guān)鍵病機(jī)為血行瘀滯，龍血竭外用具有散瘀止痛的功效，既往研究表明，其主要活性成分龍血素A在一定程度上可延緩肝、肺纖維化[3-4]，但與瘢痕疙瘩的相關(guān)性研究尚未展開，因此本研究旨在初步探討龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長的相關(guān)作用。

在本研究中，CellTiter-Blue活力檢測試驗(yàn)顯示一定濃度龍血素A處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后能夠顯著抑制細(xì)胞增殖，并且在呈劑量依賴關(guān)系，各個濃度均在48 h時抑制率最高;劃痕實(shí)驗(yàn)表明，龍血素A以濃度依賴性抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的遷移;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示龍血素A能明顯誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡，且具有一定的濃度依賴性。另本實(shí)驗(yàn)采用Western-Blot實(shí)驗(yàn)測定龍血素A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞COL-I、COL-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白水平的影響，結(jié)果顯示龍血素A以濃度依賴性抑制COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表達(dá)，同時促進(jìn)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，說明龍血素A可有效減少ECM的沉積，同時對Fb有促凋亡作用。

綜上所述，龍血素A可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、遷移并誘導(dǎo)其凋亡，同時減少COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表達(dá)，并促進(jìn)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，說明龍血素A具有調(diào)控瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的平衡、減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積的作用，從而可能對KD發(fā)揮一定的治療作用。目前KD的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但TGF-β1/Smad通路持續(xù)激活所具有的促瘢痕效應(yīng)已得到廣泛公認(rèn)[11]，因此龍血素A是否通過拮抗此通路的關(guān)鍵信號分子的表達(dá)從而發(fā)揮抗瘢痕效應(yīng)需要下一步深入研究。

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（2019-10-16收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金資助項目（2019-JYB-JS-050）作者簡介：馬卉（1989.04—），女，博士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)皮膚病方向，E-mail：446774193@sina.com通信作者：段行武（1965.07—），男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)皮膚病方向，E-mail：xwuduan@sina.com;李玲玲（1980.10—），女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)皮膚病方向，E-mail：abcling@sina.com