靈芝多糖對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟脂肪沉積及NLRP3炎性小體表達(dá)的影響

孫艷輝 張宏波

摘要 目的：探討靈芝多糖對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟脂肪沉積及NLRP3炎性小體表達(dá)的影響。方法：將48只健康KM小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及實(shí)驗(yàn)組，每組16只。模型組及實(shí)驗(yàn)組小鼠以慢性酒精喂養(yǎng)聯(lián)合急性酒精灌胃法構(gòu)建急性酒精性肝損傷小鼠模型，且實(shí)驗(yàn)組建模期間灌胃150 mg/kg靈芝多糖，1次/d。以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠肝功能及脂代謝指標(biāo);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)血清炎性反應(yīng)遞質(zhì)水平;蘇木精-伊紅（HE）染色檢測(cè)小鼠肝組織病理學(xué)形態(tài);油紅O染色觀察肝臟組織脂肪沉積;蛋白免疫印跡法（WB）檢測(cè)肝組織NLRP3炎性小體表達(dá)。結(jié)果：各組小鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），血清白細(xì)胞介素-1β（IL-1β），血清白細(xì)胞介素-6（IL-6），腫瘤壞死因子-α（TNF-α），油紅O染色評(píng)分，肝組織NLRP3炎性小體相對(duì)表達(dá)量等，模型組與對(duì)照組比較，血清AST、ALT、三酰甘油、總膽固醇、游離脂肪酸、IL-1β、IL-6、TNF-α水平，油紅O染色評(píng)分及肝組織NLRP3炎性小體相對(duì)表達(dá)量升高，而實(shí)驗(yàn)組均較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：靈芝多糖可通過(guò)抑制肝臟組織NLRP3炎性小體表達(dá)，抑制急性酒精性肝損傷小鼠炎性反應(yīng)及肝臟脂肪沉積，有效緩解肝組織損傷，恢復(fù)其肝功能。

關(guān)鍵詞 急性肝損傷;靈芝多糖;脂肪沉積;肝臟保護(hù);NLRP3炎性小體;表達(dá);肝功能;炎性反應(yīng)遞質(zhì)

Effects of Ganoderma Polysaccharide on Liver Fat Deposits and NLRP3 Inflammatory Corpuscle Expression of Mice with Acute Liver Injury

SUN Yanhui1， ZHANG Hongbo2

（1 The Emergency Department， Beijing Tiantan Hospital， Capital Medical University， Beijing100050， China; 2 Department of Obstetrics and Gynecology， Xiangya Hospital， Central South University， Changsha 410000， China）

Abstract Objective：To explore the effects of ganoderma polysaccharide on liver fat deposits and NLRP3 inflammatory corpuscle expression of mice with acute liver injury.Methods：A total of 48 healthy KM mice were randomly divided into a control group， a model group and a test group， with 16 cases were in each group.Mice in the model group and the test group were constructed an acute alcoholic liver injury mice model combined the chronic alcohol feeding with the acute alcohol lavage method， and mice in the test group were treated by the lavage method of feeding 150 mg/kg-1 ganoderma polysaccharide， once a day.The liver function and the lipid metabolism indexes of mice were detected by an automatic biochemical analyzer; the serum inflammatory factor contents were detected by an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method; the liver tissue pathology morphology of mice was observed by a hematoxylin and eosin （HE） staining; the liver tissue fat deposits of mice were observed by an oil red O staining; the NLRP3 inflammatory corpuscle expression of mice was detected by an western blot （WB） method.Results：The experimental results showed the relevant expressions of mice in every group including the serum alanine aminotransferase （ALT）， serum glutamic-oxaloacetic transaminase （AST）， serum interleukin-1β （IL-1β）， the serum interleukin-6 （IL-6）， and the tumor necrosis factor-α （TNF-α）， as well as the oil red O staining scores and the liver tissue NLRP3 inflammatory corpuscle were the same.Comparing the model group with the control group， it could be seen that the relevant expressions of the serum AST， ALT， triacylglycerol， total cholesterol， free fatty acids， IL-1β， IL-6， TNF-α， and the oil red O staining scores， and the liver tissue NLRP3 inflammatory corpuscle in the model group increased; compared with the model group， the test group level was lower， and the difference was statistically significant （all P<0.05）.Conclusion：Ganoderma polysaccharide can inhibit liver tissue NLRP3 inflammatory corpuscle protein expression， and the inflammatory response and liver fat deposits of acute alcoholic liver injury mice， so as to relieve the liver tissue damage and to restore the liver function effectively.

Keywords Acute liver injury; Ganoderma polysaccharide; Fat deposits; Liver protection; NLRP3 inflammatory corpuscle; Expression; Liver function; Inflammatory factor

中圖分類號(hào)：R284;R575文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.006

急性酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，乙醇及其毒性代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)過(guò)氧化、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等均參與其中[1-3]。靈芝多糖是多孔菌屬靈芝的主要活性成分，其藥理學(xué)作用廣泛，周婕等[4]研究報(bào)道，靈芝多糖可有效抑制D-氨基半乳糖（D-Gal）所致小鼠急性肝損傷氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有肝臟保護(hù)效應(yīng)。但目前有關(guān)其對(duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用及抗炎機(jī)制尚不明確，因此本研究探究靈芝多糖對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的肝臟脂肪沉積的影響及肝臟保護(hù)作用，并分析其對(duì)肝臟組織NLRP3炎性小體表達(dá)的影響，初步探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)、健康、雄性KM小鼠48只，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SCXK（京）2016-0011;于室溫22～25 ℃，濕度50%～65%，12 h明暗交替環(huán)境下飼養(yǎng)約6 d，完全適應(yīng)新環(huán)境后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.1.2 藥物 靈芝多糖（福州綠谷生物藥業(yè)技術(shù)研究所，生產(chǎn)批號(hào)：180713）。

1.1.3 試劑與儀器 白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（批號(hào)：20160719）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）（批號(hào)：20160803）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（批號(hào)：20160722）、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160616）購(gòu)于金斯瑞生物科技有限公司;谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測(cè)試劑盒（艾美捷科技有限公司，批號(hào)：20160519）;AU400全自動(dòng)生化分析儀、CKX41型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;Gytation3型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）;YH27020型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;Leica QWin圖像分析軟件（德國(guó)Leica公司）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將48只健康KM小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及實(shí)驗(yàn)組，每組16只。對(duì)照組小鼠則正常飼喂;模型組及實(shí)驗(yàn)組小鼠以慢性乙醇喂養(yǎng)聯(lián)合急性酒精灌胃法[5]構(gòu)建急性酒精性肝損傷小鼠模型。

1.2.2 給藥方法 其中模型組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，然后飼喂5%等體積乙醇液體飼料10 d;實(shí)驗(yàn)組小鼠則適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，然后飼喂5%等體積乙醇液體飼料10 d，期間均灌胃150 mg/kg靈芝多糖，1次/d;模型組及實(shí)驗(yàn)組小鼠均于第16天以31.5%等體積乙醇灌胃1次，0.2 mL/10 g，灌胃后禁食。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

血清肝功能[6]、血脂代謝指標(biāo)[7]及炎性反應(yīng)遞質(zhì)[8]檢測(cè)：灌胃后9 h分別采集各組小鼠靜脈血5 mL，經(jīng)3 000 r/min離心10 min分離血清，以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肝功能指標(biāo)AST及ALT及血清三酰甘油、總膽固醇、游離脂肪酸等脂代謝指標(biāo)水平;另以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)血清炎性反應(yīng)遞質(zhì)指標(biāo)：IL-1β、IL-6、TNF-α。以上檢測(cè)均嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

蘇木精-伊紅（HE）染色[9]觀察小鼠肝臟組織病理學(xué)形態(tài)：采血結(jié)束后將各組小鼠均以頸椎脫臼法處死，采集其肝臟組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)制備石蠟組織切片，并行HE染色觀察肝臟組織病理學(xué)形態(tài)變化。

油紅O染色[10]觀察小鼠肝臟脂肪沉積：肝臟組織采集同1.2.3，以最佳切削溫度包埋機(jī)進(jìn)行包埋，制備冰凍組織切片，進(jìn)行油紅O染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察脂滴在肝臟組織中的分布范圍與面積，若肝細(xì)胞內(nèi)脂滴散在分布，稀少則計(jì)0分;若肝臟組織中含有脂滴的肝細(xì)胞不超過(guò)肝臟組織面積的25%則計(jì)1分;不超過(guò)肝臟組織面積的50%則計(jì)2分;不超過(guò)肝臟組織面積的75%則計(jì)3分;若整個(gè)肝臟組織幾乎被脂滴占據(jù)則計(jì)4分。

蛋白免疫印跡（WB）法[11]檢測(cè)肝臟組織NLRP3炎性小體表達(dá)：肝臟組織采集同1.2.3，迅速置于液氮中保存，經(jīng)組織裂解液處理，提取組織總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，取適量進(jìn)行蛋白免疫印跡染色，以GADPH為內(nèi)參，經(jīng)Leica QWin圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)NLRP3炎性小體相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝功能和炎性反應(yīng)遞質(zhì)比較

模型組小鼠血清AST、ALT、三酰甘油、總膽固醇、游離脂肪酸及IL-1β、IL-6、TNF-α水平均較對(duì)照組升高，而實(shí)驗(yàn)組較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 小鼠肝臟組織病理學(xué)形態(tài)

HE染色顯示，對(duì)照組小鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，且肝細(xì)胞未見(jiàn)水腫、壞死等，肝臟組織亦未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組小鼠肝臟組織肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫大、肝細(xì)胞質(zhì)疏松并伴有明顯的脂肪變性，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大小不一的脂滴，部分肝細(xì)胞嚴(yán)重壞死，且肝臟組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯;實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟組織上述病理學(xué)變化較模型組有明顯改善。見(jiàn)圖1。

2.3 油紅O染色觀察肝臟脂肪沉積

油紅O染色顯示，對(duì)照組小鼠肝臟組織未見(jiàn)脂滴聚集;模型組小鼠肝組織可見(jiàn)大量紅色脂滴形成，且數(shù)量較多;實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織紅色脂滴較模型組顯著減少。見(jiàn)圖2。

對(duì)照組、模型組及實(shí)驗(yàn)組油紅O染色評(píng)分分別為（0.04±0.01）分、（3.61±0.97）分、（1.46±0.05）分。模型組油紅O染色評(píng)分較對(duì)照組升高，而實(shí)驗(yàn)組較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 小鼠肝臟組織NLRP3炎性小體表達(dá)情況比較? 對(duì)照組、模型組及實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟組織NLRP3炎性小體相對(duì)表達(dá)量分別為（0.21±0.09）、（0.89±0.07）、（0.43±0.06）。模型組肝組織NLRP3炎性小體相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高，而實(shí)驗(yàn)組較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討論

急性酒精性肝損傷是由于過(guò)量飲酒所導(dǎo)致肝臟代謝紊亂，且目前其發(fā)病率逐年升高[12-13]。近年來(lái)中醫(yī)藥對(duì)急性酒精性肝損傷具有顯著的防治作用，其具有靶點(diǎn)性、多環(huán)節(jié)性，且不良反應(yīng)小，具有明顯的安全優(yōu)勢(shì)[14]。靈芝多糖是從中藥?kù)`芝中所提取的多糖成分，具有顯著的保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗腫瘤、降糖等作用[15]。肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)破壞細(xì)胞膜完整性，胞質(zhì)內(nèi)ALT及AST大量外漏，其異常升高也是評(píng)估肝功能障礙的重要敏感性指標(biāo)[16];陳玉勝等[17]研究報(bào)道，靈芝多糖可通過(guò)抑制肝臟組織炎性反應(yīng)遞質(zhì)的形成，繼而降低一氧化氮合酶（NOS）活性，抑制機(jī)體炎性反應(yīng);還可通過(guò)抑制自由基脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)細(xì)胞膜完整性，發(fā)揮保肝作用。本研究中實(shí)驗(yàn)組血清AST、ALT、三酰甘油、總膽固醇、游離脂肪酸、IL-1β、IL-6、TNF-α含量及油紅O染色評(píng)分較模型組降低，提示靈芝多糖對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠亦具有顯著的保肝、降脂、抗炎、抑制脂肪沉積等作用。

目前關(guān)于靈芝多糖對(duì)急性酒精性肝損傷的抗炎、保肝作用機(jī)制尚未明確，NLRP3炎性小體是一種位于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白復(fù)合物，可通過(guò)活化Caspase-3促進(jìn)炎性反應(yīng)遞質(zhì)IL-1β、IL-18等分泌，誘導(dǎo)全身炎性反應(yīng)，且崔東娟等[18]研究報(bào)道，香葉木素通過(guò)降低NLRP3炎性小體活性有效緩解肝損傷小鼠肝纖維化，發(fā)揮保肝作用。但目前關(guān)于靈芝多糖對(duì)肝組織NLRP3炎性小體表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組肝組織NLRP3炎性小體相對(duì)表達(dá)量較模型組顯著降低，提示靈芝多糖可通過(guò)抑制肝組織NLRP3炎性小體表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用，繼而有效治療急性酒精性肝損傷小鼠，但有關(guān)其他具體分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探討。

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（2020-02-20收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2017JJ2350）作者簡(jiǎn)介：孫艷輝（1982.10—），女，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：血流動(dòng)力學(xué)，E-mail：yu_dailin@163.com