基于生物分子網(wǎng)絡(luò)的黃芪-丹參藥對干預(yù)慢性心力衰竭作用機制預(yù)測研究

章軼立 李園 劉俊杰 張建 楊雙杰 王旨引 王娟 趙慧輝 王偉

摘要：目的? 借助生物網(wǎng)絡(luò)及模塊化分析方法探索黃芪-丹參藥對治療慢性心力衰竭（CHF）的潛在作用靶點和信號，初步探索益氣活血法治療CHF可能的生物學(xué)機制。方法? 綜合利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）和中藥分子機制的生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM）、DisgeNet和HPO數(shù)據(jù)庫，分別獲得藥物有效成分、作用靶點及疾病相關(guān)治療靶點，構(gòu)建藥對與疾病間的關(guān)鍵靶標網(wǎng)絡(luò)，基于基因本體數(shù)據(jù)庫GO和KEGG通路數(shù)據(jù)庫確定靶標基因、蛋白質(zhì)分子功能、細胞內(nèi)定位及其所參與的生物學(xué)反應(yīng)和通路。結(jié)果? 黃芪-丹參藥對治療CHF的作用機制可能與調(diào)節(jié)機體內(nèi)激素的分泌、轉(zhuǎn)運、代謝，機體循環(huán)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，血液循環(huán)調(diào)節(jié)等有關(guān)，并可能作用于晝夜節(jié)律、固醇類激素合成、缺氧誘導(dǎo)因子、組氨酸代謝、腎素血管緊張素系統(tǒng)、基底轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)信號通路。結(jié)論? 黃芪-丹參藥對可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)揮治療CHF作用，“晝夜節(jié)律調(diào)控”可能成為益氣活血法治療CHF新的思路。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);黃芪;丹參;心力衰竭;生物網(wǎng)絡(luò)

中圖分類號：R285;R2-05? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）02-0093-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201901117

Study on Prediction Mechanism of Astragali Radix-Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma Medicinal Pair for Intervention of Chronic Heart Failure Based on Biomolecular Network

ZHANG Yili1， LI Yuan2， LIU Junjie1， ZHANG Jian1， YANG Shuangjie1， WANG Zhiyin1，

WANG Juan1，3，4， ZHAO Huihui1，3，4， WANG Wei1，3，4

1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China;

2. Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China;

3. Key Laboratory of Basic Research on Prescription and Syndrome， Ministry of Education， Beijing 100029， China;

4. Beijing Key Laboratory of Prescription and Syndrome Basic Research， Beijing 100029， China

Abstract： Objective To explore the potential targets and signals of Astragali Radix-Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma medicinal pair for the treatment of chronic heart failure （CHF） by means of biological networks and modular analysis methods; To preliminarily explore the possible biological mechanism of Yiqi Huoxue therapy for CHF. Methods The TCMSP and BATMAN-TCM， DisgeNet and HPO databases were used to obtain the active ingredients， targets and disease-related therapeutic targets respectively. The key target network between medicinal pairs and diseases was constructed. Target genes， protein molecular functions， intracellular localization， and the biological responses and pathways involved were determined based on GO and KEGG pathway database. Results The mechanism of Astragali Radix-Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma medicinal pair for the treatment of CHF may be related to the regulation of hormone secretion， transport， metabolism， regulation of circulatory system， regulation of blood circulation， etc.， and may act on circadian rhythm， steroid hormone synthesis， hypoxia induction factors， histidine metabolism， renin angiotensin system， basal transcription factors and other related signaling pathways. Conclusion Astragali Radix-Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma medicinal pair may play a role in the treatment of CHF?by regulating the related substances. The regulation of circadian rhythm may become a new idea for the treatment of CHF by Yiqi Huoxue therapy.

Keywords： network pharmacology; Astragali Radix; Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma; heart failure; biological network

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是一組復(fù)雜的臨床綜合征，為各種心臟疾病的嚴重或終末期階段[1]。目前臨床治療CHF主要藥物集中在利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/血管緊張素受體阻滯劑（ACEI/ARB）和β受體阻滯劑[2]。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常規(guī)治療基礎(chǔ)上，結(jié)合中醫(yī)學(xué)相應(yīng)干預(yù)措施，可提高療效、縮短病程、減少藥物不良反應(yīng)，對CHF臨床診療方案的補充具有積極作用?！堵孕牧λソ咧嗅t(yī)診療專家共識》[3]、《慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識》[4]對該病中醫(yī)病機（本虛標實、虛實夾雜）認識一致，辨證治療首推益氣活血類中藥。

“黃芪-丹參”是益氣活血治法的代表性藥對，包含該藥對的相關(guān)中成藥臨床輔助治療CHF療效滿意[5-6]，并被相關(guān)中西醫(yī)臨床實踐指南推薦[3，7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了藥學(xué)、生物學(xué)、計算機學(xué)及復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的新技術(shù)與新成果，從化合物、靶點、信號通路等多角度入手，實現(xiàn)中藥研究的綜合網(wǎng)絡(luò)分析，在預(yù)測和辨識中藥活性成分群及作用靶點、闡明作用機制、解釋組方規(guī)律、發(fā)現(xiàn)新適應(yīng)證及新活性化合物等方面，具有獨特優(yōu)勢和巨大潛力。本研究通過構(gòu)建中藥-成分-靶標-通路復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，建立中藥-化學(xué)成分-作用靶標-疾病靶標多維度關(guān)聯(lián)，以期揭示黃芪-丹參藥對的物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機制，為中醫(yī)藥治療CHF的理-法-方-藥系統(tǒng)研究提供范例。

1? 資料與方法

1.1? 藥物化學(xué)成分及作用靶點篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[8]分別篩選黃芪和丹參的主要化學(xué)成分（OB≥30%，DL≥0.18），根據(jù)每個化學(xué)成分的PubChem_Cid編號進行標準化處理。通過中藥分子機制的生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm）[9]，根據(jù)與已知藥物的結(jié)構(gòu)相似性評價和反向分子對接等方法，預(yù)測目標化合物的潛在作用靶點（P≤0.05，score≥20），獲得黃芪-丹參主要成分的潛在作用靶點，并根據(jù)靶點對應(yīng)的Uniprot編號進行規(guī)范和去重。

1.2? 疾病相關(guān)靶點篩選

通過DisgeNet數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org）[10]和HPO數(shù)據(jù)庫（https：//hpo.jax.org/）[11]獲取CHF相關(guān)靶點，根據(jù)其對應(yīng)的Uniprot編號進行規(guī)范和去重。

1.3? 藥物與疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及可視化

將黃芪-丹參作用靶點數(shù)據(jù)集與CHF相關(guān)靶點數(shù)據(jù)集進行重疊，發(fā)現(xiàn)藥物與疾病的交集基因。基于String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/network.pl）獲取已知的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）關(guān)系，將黃芪-丹參作用于CHF的作用靶點映射其中，得到黃芪-丹參作用于CHF的PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape3.0軟件實現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)的可視化和分析。

1.4? GO生物學(xué)過程及KEGG信號通路分析

通過Cytoscape3.0的ClueGO插件對黃芪-丹參與CHF靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)進行GO生物學(xué)過程和KEGG信號通路富集分析（P<0.01），預(yù)測黃芪-丹參藥對治療CHF的潛在作用機制。

2? 結(jié)果

2.1? 藥物化學(xué)成分相關(guān)靶點

TCMSP檢索得到黃芪的化學(xué)成分18個，BATMAN-TCM檢索存在高度關(guān)聯(lián)蛋白成分10個，分別為Isoflavanone、Mairin、Hederagenin、Folic Acid、Kaempferol、Astrapterocarpan、（3R）-3-（2-Hydroxy-3，4- Dimethoxyphenyl）Chroman-7-Ol、1，7-Dihydroxy-3，9- Dimethoxy Pterocarpene、Quercetin、（24S）-24- Propylcholesta-5-Ene-3Beta-Ol。TCMSP檢索得到丹參的化學(xué)成分57個，BATMAN-TCM檢索存在高度關(guān)聯(lián)蛋白成分26個，分別為Miltipolone、Salviolone、Methylenetanshinquinone、Arucadiol、（Z）-3-[2-[（E）-2- （3，4-dihydroxyphenyl）vinyl]-3，4-dihydroxy-phenyl]acrylic acid、α-amyrin、Dehydrotanshinone ⅡA、2-isopropyl- 8-methylphenanthrene-3，4-dione、Tanshinone Ⅵ、Deoxyneocryptotanshinone、Miltirone、Przewalskin B、Tanshinone Iia、Salvianolic Acid J、Manool、Digallate、Microstegiol、Neocryptotanshinone、Gamma-Sitosterol、Poriferasterol、MiltiononeⅠ、Neocryptotanshinone Ⅱ、Isotanshinone Ⅱ、Sclareol、Sugiol、Tanshinone Ⅱb。根據(jù)2種藥物的36種化學(xué)成分檢索得到相關(guān)靶點1927個，去重后共748個。

2.2? 藥物與疾病蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

DisgeNet數(shù)據(jù)庫檢索得到CHF相關(guān)靶點69個，其中與黃芪-丹參藥對的重疊靶點有16個（ACE、TNF、ADRB2、REN、AGTR1、RYR2、ACE2、TBPL1、UGT1A1、CALM1、AGT、CYP11B2、ADORA2B、ADORA2A、IFNG、HDC）。黃芪-丹參治療CHF的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖1。自由度表示PPI網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點直接相互作用的節(jié)點數(shù)目，節(jié)點越大與其相互作用的節(jié)點數(shù)越多;接近中心性反映網(wǎng)絡(luò)中某一節(jié)點與其他節(jié)點間的接近程度，節(jié)點顏色越深其接近中心性越強;關(guān)聯(lián)性評分反映網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點間的關(guān)聯(lián)性強弱，兩節(jié)點間的連線越粗其關(guān)聯(lián)性越強;中介中心性反映經(jīng)過一個點的最短路徑的數(shù)量，該值高的節(jié)點處在其他點對相互之間的捷徑上。其中，自由度最高的前10個蛋白分別為INS、EDN1、KNG1、TNF、POMC、CALM1、CALM2、F2、AGT、NPS，接近中心性最高的前10個蛋白分別為INS、EDN1、CALM1、CALM2、KNG1、TNF、F2、ACE、POMC、NFKB1;中介中心性最高的前10個蛋白分別為NFKB1、GTF2B、INS、HDC、TNF、IRF1、POMC、IFNG、KNG1、CALM2。

2.3? 潛在作用機制分析

根據(jù)對黃芪-丹參治療CHF的PPI網(wǎng)絡(luò)進行GO生物學(xué)過程和KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)共涉及407個GO功能和78條KEGG信號通路。GO生物學(xué)過程主要包括激素分泌、轉(zhuǎn)運、代謝，循環(huán)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，血液循環(huán)調(diào)節(jié)等。KEGG信號通路涉及晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)（circadian entrainment）、固醇類激素合成（steroid hormone biosynthesis）、缺氧誘導(dǎo)因子信號通路（HIF-1 signaling pathway）、組氨酸代謝（histidine metabolism）、腎素血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system）、基底轉(zhuǎn)錄因子（basal transcription factors）相關(guān)信號通路等，見表1、表2、圖2。

3? 討論

本研究基于中醫(yī)整體觀念和現(xiàn)代整合藥理學(xué)思路，預(yù)測黃芪-丹參為代表性藥對的益氣活血法治療CHF的有效成分及潛在作用靶點，有助于體現(xiàn)中藥多成分、多靶點、協(xié)同作用的特點，并可視為對“以法統(tǒng)方”“異病同治”等中醫(yī)學(xué)特色理論內(nèi)涵的有益探索，可為方證相應(yīng)研究和新藥開發(fā)提供全新的選擇與向?qū)А?/p>

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪-丹參藥對可能參與調(diào)節(jié)CHF晝夜節(jié)律的生物學(xué)過程。已有研究表明，心血管系統(tǒng)的功能組織顯示出明顯的晝夜節(jié)律性[12]。心血管疾病的相關(guān)危險因素，如激素水平[13]、睡眠周期[14-15]及血壓、心率[16-17]等均能影響心血管系統(tǒng)。相關(guān)臨床和基礎(chǔ)研究也顯示，在心律調(diào)節(jié)[18]、血壓[19]、心率[20]等方面，心力衰竭患者的癥狀體征具有一定晝夜節(jié)律性。目前，動物實驗及臨床研究初步探索了黃芪、丹參對激素調(diào)節(jié)[21]、睡眠改善[22]等的影響，提示以黃芪-丹參藥對為代表的益氣活血法治療CHF機制研究，不應(yīng)僅著眼于單一藥物的單一成分調(diào)控臨床某一/些癥狀指標，其可能通過調(diào)節(jié)這些指標背后的“晝夜節(jié)律”起效，在實驗設(shè)計與結(jié)局評價過程中，可嘗試從益氣活血法調(diào)控晝夜節(jié)律這一角度進行系統(tǒng)研究，挖掘更多晝夜節(jié)律潛在的特異性指標，發(fā)現(xiàn)更多調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的代表性藥物。

此外，本研究探索出黃芪-丹參藥對可能作用于固醇類激素合成、腎素血管緊張素系統(tǒng)、缺氧誘導(dǎo)因子信號通路等進一步干預(yù)CHF。神經(jīng)內(nèi)分泌機制在心臟收縮性心力衰竭的發(fā)展中發(fā)揮了核心作用，其中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的激活對心臟有直接不利影響[23]。近年研究發(fā)現(xiàn)，大腦中存在著完整的RAAS，對心血管系統(tǒng)具有重要調(diào)節(jié)作用，且在CHF發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[24-25]。而益氣類中藥具有抑制血液血管緊張素Ⅱ、腎素、醛固酮過度激活的作用[26]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在心力衰竭疾病進程中作用機制復(fù)雜，既對負荷過重引起的肥大心臟有保護作用，也能在心力衰竭終末期起致病作用[27]，并與抑制肌質(zhì)網(wǎng)Ca-ATP酶2 mRNA的表達密切相關(guān)[28]。有研究表明，丹參酮ⅡA可能通過上調(diào)HIF-1α表達保護腦組織，且該保護作用與HIF-1α表達量呈正相關(guān)，在一定范圍內(nèi)增加丹參酮ⅡA的劑量可以提高HIF-1α的表達[29]。此外，黃芪主要活性成分芒柄花素與HIF-1表達存在濃度-效應(yīng)關(guān)系，低濃度促進其表達，高濃度抑制其表達[30]。

本研究結(jié)果表明，黃芪-丹參藥對主要活性成分可針對多個靶點、多條通路發(fā)揮抗心力衰竭作用，可能參與調(diào)節(jié)機體內(nèi)激素的分泌、轉(zhuǎn)運、代謝，機體循環(huán)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，血液循環(huán)調(diào)節(jié)等，并可能作用于晝夜節(jié)律、固醇類激素合成、缺氧誘導(dǎo)因子、組氨酸代謝、腎素血管緊張素系統(tǒng)、基底轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)信號通路。本研究結(jié)果可為益氣活血法干預(yù)心血管相關(guān)疾病及氣虛血瘀證候調(diào)節(jié)的機制研究提供一定參考，并為進一步探索該治法臨床運用及驗證性研究提供基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會心力衰竭學(xué)組.中國心力衰竭診斷和治療指南2018[J].中華心血管病雜志，2018，46（10）：760-789.

[2] ZHANG Y H， ZHANG J， BUTLER J， et al. Contemporary epidemiology， management， and outcomes of patients hospitalized for heart failure in China：Results from the China heart failure （China-HF） registry[J]. Journal of Cardiac Failure，2017，23（1）：868-875.

[3] 冠心病中醫(yī)臨床研究聯(lián)盟.慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識[J].中醫(yī)雜志，2014，55（14）：1258-1261.

[4] 中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會心血管疾病專業(yè)委員會.慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，36（2）：133-142.

[5] 王永霞，毋領(lǐng)娟，李彬，等.中醫(yī)藥治療慢性心力衰竭系統(tǒng)評價現(xiàn)狀分析[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（2）：687-691.

[6] 孫麗霞，姬延平，蘇軍，等.芪參益氣滴丸治療冠心病缺血性心力衰竭的療效[J].心腦血管病防治，2018，18（1）：65-68.

[7] 中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會心力衰竭學(xué)組.中國心力衰竭診斷和治療指南2018[J].中華心血管病雜志，2018，46（10）：760-789.

[8] RU J， LI P， WANG J， et al. TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. J Cheminform，2014，6：13.

[9] LIU Z， GUO F， WANG Y， et al. BATMAN-TCM：a bioinformaticsanalysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine[J]. Sci Rep，2016，6：21146.

[10] PINERO J， QUERALT-ROSINACH N， BRAVO A， et al. DisGeNET：a discovery platform for the dynamical exploration of human diseases and their genes[J]. Database （Oxford），2015，2015：v28.

[11] KOHLER S， VASILEVSKY N A， ENGELSTAD M， et al. The human phenotype ontology in 2017[J]. Nucleic Acids Res，2017，45（D1）：D865-D876.

[12] PORTALUPPI F， TISEO R， SMOLENSKY M H， et al. Circadian rhythms and cardiovascular health[J]. Sleep Medicine Reviews，2012，16：151-166.

[13] SHANMUGAM V， WAFI A， AL-TAWEEL N， et al. Disruption of circadian rhythm increases the risk of cancer， metabolic syndrome and cardiovascular disease[J]. Journal of Local and Global Health Science，2013.http：//dx.doi.org/10.5339/jlghs.2013.3.

[14] MORRIS C J， PURVIS T E， HU K， et al. Circadian misalignment increases cardiovascular disease risk factors in humans[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2016，113（10）：E1402-E1411.

[15] YAMANAKA Y， HASHIMOTO S， MASUBUCHI S， et al. Differential regulation of circadian melatonin rhythm and sleep-wake cycle by bright lights and nonphotic time cues in humans[J]. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology，2014，307（5）：R546-R557.

[16] CHEN L H， YANG G R. Recent advances in circadian rhythms in cardiovascular system[J]. Frontiers in Pharmacology，2015，6：7.

[17] SCHRODER E A， BURGESS D E， ZHANG X P， et al. The cardiomyocyte molecular clock regulates the circadian expression of Kcnh2 and contributes to ventricular repolarization[J]. Heart Rhythm，2015， 12（6）：1306-1314.

[18] 詹龍亮.心力衰竭患者室性心律失常的晝夜節(jié)律規(guī)律探討[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2018，34（9）：133-134.

[19] 原琳，田軼倫，聶紹平.晝夜血壓節(jié)律異常對擴張型心肌病患者預(yù)后的影響[J].中國循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2017，9（5）：545-549.

[20] 李海濤，吳明，馬建林，等.晝夜節(jié)律對心力衰竭兔心肌細胞鈣火花發(fā)生率及時空特性的影響[J].海南醫(yī)學(xué)，2014，25（21）：3121-3123.

[21] 侯麗芳，首云鋒.丹參多酚酸鹽注射液對PCI術(shù)相關(guān)心肌損傷及神經(jīng)內(nèi)分泌激素、血管內(nèi)皮功能及心功能的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2018，27（23）：2573-2576.

[22] 李光芒.內(nèi)補黃芪湯加味治療頑固性失眠64例[J].實用中醫(yī)藥雜志， 2012，28（1）：18.

[23] 王希.腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活對心血管疾病的影響[J].心血管病防治知識，2017（2）：123-124.

[24] ISEGGAWA K， HIROOKA Y， KATSUKI M， et al. Angiotensin Ⅱ type 1 receptor expression in astrocytes is upregulated leading to increased mortality in mice with myocardial infarction-induced heart failure[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2014，307（10）：H1448-H1455.

[25] TSUDA K. Renin-angiotensin system and sympathetic neurotransmitter release in the central nervous system of hypertension[J]. Int J Hypertens，2012，2012：474870.

[26] 韓麗華，王振濤，柴松波，等.溫陽、益氣方藥對心肌梗死后心力衰竭大鼠腎素、血管緊張素Ⅱ及醛固酮時相性變化的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（11）：4103-4105.

[27] SEMENZA G L. Hypoxia-inducible factor 1 and cardiovascular disease[J]. Annu Rev Physiol，2014，76：39-56.

[28] REVUELTA-LOPEZ E， CAL R， HERRAIZ-MARTINEZ A， et al. Hypoxia- driven sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2 （SERCA2） down-regulation depends on low-density lipoprotein receptor-related protein 1 （LRP1）-signalling in cardiomyocytes[J]. J Mol Cell Cardiol，2015，85：25-36.

[29] 陳晨，王利玲.丹參酮ⅡA對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷時低氧誘導(dǎo)因子1α基因表達的影響[J].新中醫(yī)，2018，50（12）：16-19.

[30] 梁麗娟，董婷霞，詹華強，等.黃芪中7種活性成分對缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）表達的影響[J].中國藥房，2010，21（47）：4422-4424.

（收稿日期：2019-01-10）

（修回日期：2019-02-26;編輯：陳靜）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2017YFC1700100、2017YFC1700102）

通訊作者：王偉，E-mail：wangwei@bucm.edu.cn