電針對(duì)腦卒中肢體痙攣大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB 及GABAa表達(dá)的影響

謝志強(qiáng) 謝莉娜 郭斌 劉未艾 黃麟荇 王彭漢 岳增輝

摘要：目的? 觀察電針對(duì)腦卒中肢體痙攣大鼠皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、酪氨酸激酶受體B（TrkB）、γ-氨基丁酸（GABA）受體（GABAa）表達(dá)的影響，探討電針治療腦卒中肢體痙攣的機(jī)制。方法? 將77只SD雄性大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組各9只及模型儲(chǔ)備組59只，運(yùn)用Zea Longa線栓結(jié)合內(nèi)囊注射NMDA受體制作腦卒中肢體痙攣大鼠模型。18只成模大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組。電針組取雙側(cè)陽陵泉、曲池針刺，每次30 min，每日1次，連續(xù)5 d;假手術(shù)組和模型組同期只固定不作任何干預(yù)，空白組不作任何處理。觀察各組大鼠Zea Longa評(píng)分，改良Ashworth肌張力量表評(píng)分，皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果? 與空白組、假手術(shù)組比較，模型組和電針組大鼠治療前行為學(xué)評(píng)分明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，電針組大鼠治療后行為學(xué)評(píng)分明顯降低（P<0.05）;與空白組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，電針組大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）。結(jié)論? 電針可改善腦卒中肢體痙攣大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及肌張力，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)模型大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：電針;腦卒中;肢體痙攣;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;酪氨酸激酶受體B;γ-氨基丁酸受體;大鼠

中圖分類號(hào)：R245? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2020）02-0023-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201905042

Effects of Electroacupuncture on Expressions of BDNF， TrkB and GABAa

in Cortex of Rats with Limb Spasm after Stroke

XIE Zhiqiang， XIE Lina， GUO Bin， LIU Weiai， HUANG Linxing， WANG Penghan， YUE Zenghui

College of Acupuncture and Massage， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture on the expressions of BDNF， TrkB and GABAa in the cortex of rats with limb spasm after stroke; To explore the mechanism of electroacupuncture in the treatment of limb spasm after stroke. Methods Totally 77 SD male rats were randomly divided into blank group （9 cases）， sham-operation group （9 cases）， and model reserve group （59 cases）. Rat model with limb spasm after stroke was prepared by using Zea Longa suture-occluded and injecting of NMDA receptor in inner capsule. Then， the successfully prepared 18 rats were randomly divided into the model group and the electroacupuncture group. In the electroacupuncture group， electroacupuncture was used to stimulate Yanglingquan （GB34） and Quchi （LI11） once a day for 30 min each time， for consecutive 5 d. The sham-operation group and the model group just fixed at the same time without any intervention， while the blank group received no treatment. Zea Longa score， the modified Ashworth Tension Scale， and the mRNA and protein expressions of BDNF， TrkB， and GABAa in the cortex were observed. Results Compared with the blank group and the sham-operation group， the behavioral score of model group and electroacupuncture group increased significantly （P<0.01）. After treatment， compared with the?model group， the behavioral score of the electroacupuncture group decreased significantly （P<0.05）. Compared with the blank group and the sham-operation group， the mRNA and protein expressions of BDNF， TrkB， and GABAa in the cortex of the model group decreased significantly （P<0.05）， while the mRNA and protein expressions of BDNF， TrkB， GABAa in the cortex of the electroacupuncture group increased significantly compared with the model group （P<0.05）. Conclusion Electroacupuncture can improve neurological function score and muscle tone in rats with limb spasm after stroke， which may be through the regulation of cortical BDNF， TrkB， and GABAa.

Keywords： electroacupuncture; stroke; limb spasm; BDNF; TrkB; GABAa; rats

腦卒中后80%～90%患者出現(xiàn)不同程度的肢體痙攣，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。肢體痙攣發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)是神經(jīng)遞質(zhì)的失衡與紊亂[1]。興奮性遞質(zhì)增加或抑制性遞質(zhì)減少均會(huì)引起和加重肢體痙攣。γ-氨基丁酸（GABA）作為抑制性遞質(zhì)的代表性物質(zhì)，與其受體結(jié)合，產(chǎn)生突觸前抑制作用，從而緩解肢體痙攣。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）與酪氨酸激酶受體B（tyrosibe kinase，TrkB）結(jié)合后，能促進(jìn)GABA及其受體GABAa的表達(dá)。課題組前期研究顯示，電針陽陵泉、曲池能改善腦卒中肢體痙攣大鼠肌張力，其機(jī)制與上調(diào)腦卒中肢體痙攣大鼠皮質(zhì)GABA及其受體GABAb的表達(dá)有關(guān)[2]。本研究觀察電針對(duì)腦卒中肢體痙攣大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa表達(dá)的影響，探討電針治療腦卒中肢體痙攣的相關(guān)機(jī)制。

1? 材料與方法

1.1? 動(dòng)物及分組

77只SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。隨機(jī)分為空白組（9只）、假手術(shù)組（9只）、模型儲(chǔ)備組（59只，造模成功后分為模型組和電針組，每組9只）。

1.2? 主要試劑與儀器

水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），NMDA受體（武漢華聯(lián)科試劑公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型，Bioswamp，PAB180007），SYBR Green PCR試劑盒（KAPA Biosystems，KM4101），BDNF抗體（Abcam，ab108319），TrkB抗體（Abcam，ab18987），GABAa抗體（Bioss，bs-1232R）。大鼠腦立體定位儀（日本成茂公司，SN-2），SDZ-V電針儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），0.30 mm×13 mm一次性針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司，MK3），熒光定量PCR儀（Bio-Rad，CFX-Connect 96），超微量分光光度計(jì)（杭州奧盛儀器有限公司，Nano-300），栓線（北京西濃科技有限公司，2838-50A4）。

1.3? 造模

采用Zea Longa線栓法結(jié)合內(nèi)囊注射NMDA受體制作腦卒中肢體痙攣模型[3]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉。將麻醉后大鼠固定在手術(shù)臺(tái)，備皮消毒，沿頸部正中偏右切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)后，分別在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端、頸內(nèi)動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈近心端備線，然后分別結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端、頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈。在離頸總動(dòng)脈分叉膨大處5 mm切口，將栓線經(jīng)切口插入頸內(nèi)動(dòng)脈，松開動(dòng)脈夾，栓線深度18～20 mm時(shí)稍感阻力停止插線。插線完畢后，將頸內(nèi)動(dòng)脈近心端和栓線一起結(jié)扎，逐層縫合切口，縫合處撒適量青霉素。大鼠清醒后通過神經(jīng)功能評(píng)分判斷造模是否成功。成模大鼠第2日行內(nèi)囊注射NMDA受體。參照內(nèi)囊電毀損法[4]。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠頭頂部備皮，把5 μL微量注射器（內(nèi)含NMDA受體）固定于大鼠腦立體定位儀。同時(shí)將大鼠俯臥固定于大鼠腦立體定位儀，使用定位輔助裝置。沿顱頂矢狀縫作縱行切口，長(zhǎng)約2 cm，分離筋膜暴露前囟，手術(shù)鉗向兩側(cè)拉開，暴露右側(cè)頂骨和額骨交界骨縫。參照《大鼠立體定位圖譜》[5]確定內(nèi)囊位置，選擇前囟后1.4 mm、矢狀縫右側(cè)2.4 mm，用小型電鉆在顱板上鉆一直徑約2 mm小孔，將微量注射器垂直插入7 mm，緩慢注射5 μL NMDA受體，注射時(shí)間維持5 min。注射完畢后拔出微量注射器，用明膠海棉壓迫止血，碘伏消毒，傷口局部撒青霉素，最后縫合。上述造模術(shù)后均按0.1 mg/kg劑量注射呋塞米，防止腦水腫。術(shù)后予葡萄糖水及飼料喂養(yǎng)，單籠飼養(yǎng)，保持呼吸道通暢。

假手術(shù)組線栓造模時(shí)僅分離頸總動(dòng)脈、迷走神經(jīng)、頸內(nèi)外動(dòng)脈，不進(jìn)行插線及結(jié)扎;內(nèi)囊注射NMDA受體造模時(shí)，內(nèi)囊注射5 μL生理鹽水，余步驟同模型組。

1.4? 干預(yù)

電針組：造模成功后第1日，大鼠固定于鼠板，針刺雙側(cè)陽陵泉、曲池，穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[6]，并結(jié)合解剖學(xué)方法進(jìn)行大鼠穴位定位。陽陵泉：距后三里（在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處）上外側(cè)5 mm。曲池：橈骨近端的關(guān)節(jié)外側(cè)前方凹陷。連接SDZ-V電針治療儀，波型為密波，頻率100 Hz，強(qiáng)度以大鼠肢體輕微抖動(dòng)為度。每次30 min，每日1次，連續(xù)5 d。空白組不作任何處理，假手術(shù)組及模型組除與電針組同期只固定不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.5? 行為學(xué)檢測(cè)

分別在治療前及治療后參照Zea Longa標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分[7]，1～3分提示模型成功。0分：無神經(jīng)損傷癥狀;1分：不能完全伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前爪或后爪;2分：行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分：行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒;4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。分別在治療前及治療后運(yùn)用改良Ashworth肌張力量表進(jìn)行肌張力評(píng)定[8]，1～4級(jí)提示模型成功。0級(jí)：無肌張力升高，大鼠活動(dòng)自如;1級(jí)：輕度增加，抓握中被動(dòng)屈伸至最后有小的阻力;1+級(jí)：輕度增加，抓握至一半運(yùn)動(dòng)半徑以上有輕度阻力增加;2級(jí)：肌張力在大部分運(yùn)動(dòng)半徑中都有較大增加，但肢體被動(dòng)運(yùn)動(dòng)容易;3級(jí)：肌張力明顯增高，被動(dòng)活動(dòng)困難;4級(jí)：受累部分肢體強(qiáng)直性屈曲或伸直。

1.6? 標(biāo)本采集

治療第5日進(jìn)行Zea Longa評(píng)分及改良Ashworth量表評(píng)分后，大鼠斷頭處死，剪開顱板，取腦組織，冰盤上取出患側(cè)皮質(zhì)，剝離后立即放入液氮速凍，-80 ℃保存，待測(cè)BDNF、TrkB、GABAa mRNA及蛋白表達(dá)。

1.7? 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、受體酪氨酸蛋白激酶和γ-氨基丁酸受體mRNA表達(dá)取樣本勻漿20 s，迅速置于冰上，溫育5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入氯仿，再離心10 min，取上清液，加異丙醇，離心10 min，棄上清液，沉淀，75%乙醇漂洗2次，7500 r/min離心5 min，加入DEPC水溶解RNA，得RNA溶液，之后進(jìn)行總RNA中DNA、DNase1的消除，反轉(zhuǎn)錄完成后，將其產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算2-ΔΔCt值。引物序列見表1。

1.8? Western blot檢測(cè)皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、酪氨酸激酶受體B和γ-氨基丁酸受體蛋白表達(dá)

組織剪碎，按比例加裂解液（20 mg/150～250 μL），將勻漿后樣品離心，取上清液，根據(jù)BCA試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度，蛋白質(zhì)定量貯存于-80 ℃冰箱備用。PAGE膠制備完成后，樣品電泳，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后封閉，孵育一抗、二抗。最后待膜正面與ECL發(fā)光液充分接觸后，置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.9? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以—x±s表示，不符合正態(tài)分布的則以中位數(shù)和四分位間距[M（QR）]表示，多組計(jì)量資料比較，符合正態(tài)分布采用方差分析，不符合正態(tài)分布采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 一般狀況

模型儲(chǔ)備組59只大鼠線栓造模死亡11只，死亡原因?yàn)槁樽硎д`、失血過多等;剩余48只清醒后進(jìn)行Zea Longa神經(jīng)功能評(píng)分，剔除0、4分大鼠6只，故通過評(píng)定符合模型成功標(biāo)準(zhǔn)共42只。成模大鼠進(jìn)行內(nèi)囊注射NMDA受體制作痙攣模型，手術(shù)過程中死亡21只，死亡原因?yàn)槁樽聿划?dāng)、固定不當(dāng)、傷口感染、失血過多等;剩余21只大鼠清醒后進(jìn)行改良Ashworth肌張力評(píng)定，剔除0級(jí)大鼠3只，共納入18只大鼠。

2.2? 電針對(duì)腦卒中肢體痙攣大鼠Zea Longa評(píng)分的影響

與空白組比較，假手術(shù)組治療前大鼠Zea Longa評(píng)分無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組、電針組大鼠Zea Longa評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示造模成功。模型組與電針組大鼠治療前Zea Longa評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有齊同可比性;與模型組比較，電針組治療后評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表2。

2.3? 電針對(duì)腦卒中肢體痙攣大鼠改良Ashworth肌張力量表評(píng)分的影響

治療前與空白組比較，假手術(shù)組大鼠Ashworth評(píng)分無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組、電針組大鼠Ashworth評(píng)分均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示造模成功。模型組與電針組大鼠治療前Ashworth評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，電針組治療后大鼠Ashworth評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表3。

2.4? 電針對(duì)腦卒中肢體痙攣大鼠皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、酪氨酸激酶受體B和γ-氨基丁酸受體mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa mRNA表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，電針組大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表4。

2.5? 電針對(duì)腦卒中肢體痙攣大鼠皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、酪氨酸激酶受體B和γ-氨基丁酸受體蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa蛋白表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，電針組大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表5。

3? 討論

腦卒中后高級(jí)中樞受損導(dǎo)致低級(jí)中樞處于失控狀態(tài)，低級(jí)中樞α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)出現(xiàn)異常興奮，從而出現(xiàn)肢體痙攣。GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的代表，參與正常肌張力維持的過程，其與相應(yīng)受體GABAa結(jié)合后，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，抑制低級(jí)中樞α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元異常興奮。BDNF作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員之一，對(duì)大腦生理功能及突觸相關(guān)功能產(chǎn)生重要影響[9]。腦卒中發(fā)生后，BDNF對(duì)神經(jīng)起到保護(hù)作用，同時(shí)促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[10]，并參與神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)。TrkB是BDNF的受體，兩者結(jié)合具有高度特異性。研究表明，在磷酸肌醇3-激酶和蛋白激酶C的作用下，BDNF與TrkB結(jié)合后能增加GABA的表達(dá)，促進(jìn)GABAa的表達(dá)。另有研究顯示，衰老過程中BDNF分泌減少導(dǎo)致GABA表達(dá)下調(diào)，而給予外源性BDNF可上調(diào)GABAa的表達(dá)[11-12]。

腦卒中肢體痙攣屬中醫(yī)學(xué)“痙證”范疇，其發(fā)病部位在筋。《景岳全書》記載：“氣中無血，則病為抽掣拘攣?！睔庋脴s，則筋脈濡養(yǎng)有道;氣血津液虧虛不足，筋脈得不到滋養(yǎng)，則會(huì)引起筋脈攣縮。陽陵泉為筋會(huì)，主治筋病，《針灸聚英》有“主膝伸不得屈……偏風(fēng)半身不遂……足筋攣”，具有舒筋、壯筋的作用。曲池為手陽明經(jīng)合穴，陽明經(jīng)多氣多血?！秲?nèi)經(jīng)》中“治痿獨(dú)取陽明”為臨床治療中風(fēng)的選穴依據(jù)，另《醫(yī)宗金鑒》記載曲池“主治中風(fēng)，手?jǐn)伣罴薄薄；谏鲜隼碚?，陽陵泉、曲池在腦卒中治療肢體痙攣中廣泛應(yīng)用，并且兩者能有效緩解腦卒中肢體痙攣[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模后大鼠行為學(xué)評(píng)分降低，經(jīng)電針治療后行為學(xué)評(píng)分增加，提示電針能有效改善腦卒中肢體痙攣大鼠神經(jīng)功能及肌張力。另外，造模后大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa表達(dá)下降，與已報(bào)道的文獻(xiàn)一致[15]。也有研究顯示，腦卒中模型大鼠BDNF、TrkB表達(dá)升高[16-17]。分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)的原因可能是腦卒中發(fā)生后，神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞受損，導(dǎo)致BDNF、TrkB分泌不足。經(jīng)電針治療后，大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa表達(dá)均升高。提示電針能上調(diào)腦卒中肢體痙攣大鼠皮質(zhì)BDNF、TrkB、GABAa的表達(dá)。

綜上，結(jié)合行為學(xué)及分子生物學(xué)結(jié)果，證實(shí)電針能有效改善腦卒中肢體痙攣，其具體機(jī)制可能是電針促進(jìn)BDNF與TrkB的表達(dá)，兩者結(jié)合后進(jìn)一步促進(jìn)GABAa的表達(dá)，GABAa表達(dá)的增加，增強(qiáng)其與GABA結(jié)合后產(chǎn)生的突觸抑制作用，進(jìn)而改善腦卒中后肢體痙攣狀態(tài)。

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（收稿日期：2019-05-05）

（修回日期：2019-06-25;編輯：華強(qiáng)）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81673886）;湖南省自然科學(xué)基金（2018JJ2294）;湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（201828）;湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2018B488）

通訊作者：岳增輝，E-mail：624755064@qq.com