補腎化濁方聯(lián)合糞菌移植對來曲唑誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征大鼠生殖、代謝功能及相關(guān)炎癥因子的影響

肖慧 劉艷霞 仰艷 邢雅雯 易莎 征征 邢玉

摘要：目的? 以腸道微生態(tài)為切入點探討補腎化濁方聯(lián)合糞菌移植治療多囊卵巢綜合征（PCOS）潛在機制。方法? 將30只6周齡SD大鼠隨機分為空白組、模型組、中藥組、糞菌移植組、中藥+糞菌移植組，每組6只。來曲唑1 mg/（kg·d）灌胃51 d，第22日起，中藥組加灌補腎化濁方21.7 g/（kg·d），糞菌移植組加灌新鮮糞便2 g/（kg·d），中藥+糞菌移植組加灌補腎化濁方21.7 g/（kg·d）和新鮮糞便2 g/（kg·d），連續(xù)30 d，另設(shè)空白組。干預(yù)結(jié)束后，腹主動脈取血檢測大鼠血清性激素、空腹胰島素（FINS）、空腹血糖（FPG），ELISA檢測大鼠血清白細胞介素（IL）-18、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，HE染色觀察大鼠卵巢形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果? 與空白組比較，模型組大鼠卵巢呈多囊樣改變，體質(zhì)量、睪酮、黃體生成素（LH）/促卵泡激素（FSH）、FPG、HOMA-IR、IL-18、TNF-α水平均明顯升高（P<0.01，P<0.001）;與模型組比較，中藥+糞菌移植組可顯著改善上述指標（P<0.05，P<0.01，P<0.001），中藥組可顯著改善除TNF-α外各項指標（P<0.05，P<0.01），糞菌移植組可顯著降低PCOS大鼠LH/FSH、IL-18水平（P<0.01，P<0.001）;在降低IL-18水平方面，中藥+糞菌移植組作用顯著優(yōu)于中藥組（P<0.01）。結(jié)論? 中藥聯(lián)合糞菌移植可顯著改善PCOS大鼠生殖和代謝功能，改善慢性炎癥狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：多囊卵巢綜合征;糞菌移植;補腎化濁方;胰島素抵抗;大鼠

中圖分類號：R285.5? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）02-0033-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201908213

Effects of Bushen Huazhuo Prescription Combined with Fecal Microbiota Transplantation

on Polycystic Ovary Syndrome Induced by Letrozole in Rats

XIAO Hui1， LIU Yanxia2， YANG Yan2， XING Yawen1， YI Sha1， ZHENG Zheng1， XING Yu2

1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China;

2. Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China

Abstract： Objective To investigate the potential mechanism of Bushen Huazhuo Prescription （BSHZ） combined with fecal microbiota transplantation （FMT） in polycystic ovary syndrome （PCOS） induced by letrozole in rats by taking intestinal micro-ecology as an entry point. Methods Thirty six-week old SD rats were divided into control group， model group， TCM group， FMT group and TCM combined with microbiota transplantation （TCM+FMT） group， with 6 rats in each group. Rats were treated with letrozole by gavage for 51 days. From the 22nd day， TCM group was treated with BSHZ [21.7 g/（kg·d）] for 30 days， FMT group was treated with fresh fecal [2 g/（kg·d）] for 30 days， and TCM+FMT group was treated with both BSHZ [21.7 g/（kg·d）] and fresh fecal [2 g/（kg·d）] for 30 days. The control group was established. After the treatment， abdominal aortic blood was taken to detect the levels of serum sex hormone， fasting insulin （FINS）， fasting plasma glucose （FPG）. The levels of serum IL-18 and TNF-α were detected by ELISA. The ovary tissue was observed by HE staining. Results Compared with control group， there were more cyst-like follicles in ovary tissue， and the weight， the testosterone， luteinizing hormone （LH）/follicle stimulating hormone （FSH）， FPG， HOMA-IR IL-18， and TNF-α all increased in model group （P<0.01， P<0.001）; Compared with model group， all indexes above in TCM+FMT group increased （P<0.05， P<0.01， P<0.001）， and TCM group improved almost all indexes above except for TNF-α （P<0.05， P<0.01）. FMT group could significantly decrease LH/FSH andthe level of serum IL-18 （P<0.01， P<0.001）. TCM+FMT group was better than TCM group in decreasing the levels of IL-18 （P<0.01）. Conclusion TCM combined with fecal microbiota transplantation can significantly improve the reproductive function， metabolism， and chronic inflammatory state of PCOS rats.

Keywords： polycystic ovary syndrome; fecal microbiota transplantation; Bushen Huazhuo Prescription; insulin resistance; rats

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是最常見的影響育齡期女性生殖內(nèi)分泌疾病，其發(fā)病率約占8%～13%[1]。PCOS可引起約80%排卵障礙性不孕[2]，使患妊娠糖尿病、子癇前期、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等妊娠相關(guān)疾病[3]，以及抑郁癥、抑郁癥、卒中、子宮內(nèi)膜癌等患病風(fēng)險增加，嚴重危及女性健康。國外最新研究表明，腸道菌群在PCOS的發(fā)病中起重要作用[4]。中醫(yī)藥治療PCOS療效確切[5]，但機制尚不明確。補腎化濁方是治療PCOS的經(jīng)驗方，糞菌移植是研究腸道菌群與疾病相關(guān)性的重要方法。本實驗復(fù)制來曲唑誘導(dǎo)的大鼠模型，以補腎化濁方聯(lián)合糞菌移植進行干預(yù)，研究中藥聯(lián)合糞菌移植對PCOS大鼠體質(zhì)量、卵巢形態(tài)、性激素、血糖、炎癥因子等水平的影響，探討中藥聯(lián)合糞菌移植治療PCOS的潛在機制。

1? 材料與方法

1.1? 動物

雌性SD大鼠30只，SPF級，6周齡，體質(zhì)量（200±10）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級屏障環(huán)境，12 h光照/黑夜循環(huán)，溫度25 ℃，濕度60%，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

補腎化濁方（菟絲子15 g，枸杞子15 g，清半夏8 g，當歸15 g，茯苓15 g，丹參20 g，制香附10 g，川芎10 g，白芍15 g，甘草6 g，青皮6 g，薏苡仁20 g，車前子10 g，桔梗10 g，敗醬草20 g，冬瓜皮30 g），飲片購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，常規(guī)煎制，制成含5.35 g原藥材/mL;來曲唑片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號190316KG。

1.3? 主要試劑與儀器

黃體生成素（LH）測定試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號20190512），促卵泡激素（FSH）測定試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號20190516），血清睪酮（T）測定試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號20190602），白細胞介素-18（IL-18）酶聯(lián)免疫試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20190404），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20190410），血糖酶法試劑盒（北京百奧泰康生物技術(shù)有限公司，批號DL201901），胰島素放射免疫法試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號20190503）。離心機（恒諾儀器，AXTGL16M），切片機（Leica，RM2235），石蠟包埋機（Leica G1150H），全自動生化儀（日本奧林巴斯株式會社，AU480），γ放射免疫計數(shù)器（西安核儀器廠，XH-6080），全自動酶標儀（THERMO V.2.3）。

1.4? 分組、造模和給藥

采用隨機數(shù)字表法將30只大鼠隨機分為空白組、模型組、中藥組、糞菌移植組、中藥+糞菌移植組，每組6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將來曲唑1 mg/（kg·d）溶于1%羧甲基纖維素（CMC）中，除空白組外，其余各組大鼠連續(xù)灌服21 d，復(fù)制PCOS大鼠模型[6]?？瞻捉M大鼠同期灌服等體積等濃度基質(zhì)CMC，第22日起，除空白組灌服CMC外，其余各組繼續(xù)灌服來曲唑藥液1 mg/（kg·d），中藥組加灌補腎化濁方藥液21.7 g/（kg·d）[7]，糞菌移植組加灌空白組新鮮糞便（收集4 g空白組新鮮糞便，于20 mL生理鹽水中混勻，3 min后灌服[8]）2 g/（kg·d），中藥+糞菌移植組加灌補腎化濁方藥液21.7 g/（kg·d）和空白組新鮮糞便2 g/（kg·d）。每日1次，連續(xù)30 d。

1.5? 取材

最后1次給藥后，大鼠饑餓12 h，腹腔注射0.4%戊巴比妥（l mL/100 g）麻醉，75%酒精消毒腹部皮膚，打開腹腔，腹主動脈取血，取大鼠卵巢，4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，HE染色，鏡下觀察。

1.6? 血清學(xué)檢測

大鼠腹主動脈取血4 mL，1500 r/min離心5 min，取血清，放射免疫法檢測血清T、FSH、LH、空腹胰島素（FINS），酶法檢測空腹血糖（FPG），計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR，F(xiàn)PG×FINS÷22.5），ELISA檢測血清IL-18、TNF-α水平。

1.7? 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示。多組比較符合正態(tài)分布且方差齊用ANOVA檢驗，若P<0.05采用LSD進行兩兩比較;如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊則采用非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 中藥聯(lián)合糞菌移植對大鼠體質(zhì)量的影響

中藥組和中藥+糞菌移植組各1只大鼠在實驗第35、28日因灌胃操作不當于10 min內(nèi)死亡。與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）;與模型組比較，中藥組和中藥+糞菌移植組大鼠體質(zhì)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），糞菌移植組大鼠體質(zhì)量與模型組比較無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2? 中藥聯(lián)合糞菌移植對大鼠性激素水平的影響

與空白組比較，模型組大鼠LH/FSH、T水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.001）;與模型組比較，中藥組、糞菌移植組和中藥+糞菌移植組LH/FSH、T水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見表2。

2.3? 中藥聯(lián)合糞菌移植對大鼠卵巢組織形態(tài)的影響

空白組大鼠可見優(yōu)勢卵泡和黃體;模型組大鼠無優(yōu)勢卵泡，有較多小卵泡;中藥組、糞菌移植組、中藥+糞菌移植組大鼠小卵泡較模型組明顯減少，且可見排卵后黃體或較大卵泡。見圖1。

2.4? 中藥聯(lián)合糞菌移植對大鼠空腹血糖、空腹胰島素及胰島素抵抗指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組大鼠空腹血糖、HOMA-IR水平顯著升高（P<0.001，P<0.01）;與模型組比較，中藥組、中藥+糞菌移植組FPG、HOMA-IR水平顯著降低（P<0.01，P<0.05）。結(jié)果見表3。

2.5? 中藥聯(lián)合糞菌移植對大鼠血清白細胞介素-18、腫瘤壞死因子-α水平的影響

與空白組比較，模型組大鼠IL-18、TNF-α水平顯著升高（P<0.001）;與模型組比較，中藥組、糞菌移植組、糞菌移植+中藥組大鼠IL-18水平均顯著降低（P<0.05，P<0.001），中藥+糞菌移植組大鼠TNF-α水平顯著降低（P<0.01）;與中藥組比較，中藥+糞菌移植組大鼠IL-18水平顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見表4。

3? 討論

人類腸道中有超過100萬億個微生物，被稱為“成人的第二大腦”，腸道菌群基因又被看作“人類第二基因組”[9]。研究表明，PCOS患者與正常女性比較，腸道菌群α多樣性降低[10-11]。最新研究表明，分別以PCOS和正常者糞便給予小鼠灌胃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植PCOS菌群小鼠表現(xiàn)出胰島素抵抗、動情周期紊亂、生育力下降、卵巢組織中小卵泡增多和黃體減少，而移植正常人群腸道菌群小鼠并無上述表現(xiàn)，提示腸道菌群與PCOS表現(xiàn)密切相關(guān)[4]。中西醫(yī)結(jié)合治療PCOS優(yōu)勢突出。本研究所用補腎化濁方為劉艷霞教授治療PCOS經(jīng)驗方。本病病機為本虛標實，虛主要為腎虛，實為痰、濕、瘀互結(jié)，吳鞠通謂“濕久濁凝”，痰濁下注，凝聚沖任、胞宮。治宜補腎活血、燥痰化濁。補腎化濁方由五子衍宗丸、四物湯、二陳湯、薏苡附子敗醬散、芍藥甘草湯合方加減化裁而成。方中菟絲子、枸杞子補腎填精，共為君藥，以治本。當歸活血補血，清半夏燥濕化痰，以治標;茯苓健脾利濕，既以后天補先天，助君藥以固本，又利濕以治標。上3味共為臣藥。川芎、白芍、丹參，佐助當歸以活血祛瘀;青皮、制香附相伍疏肝理氣行滯，既佐助半夏以消痰，又可行氣以活血;車前子、薏苡仁、冬瓜皮，佐助茯苓以利濕通淋;桔梗祛痰利氣，敗醬草清熱祛痰、活血祛瘀。上10味共為佐藥。甘草與芍藥共用，酸甘化陰，佐助當歸以補陰血，又可調(diào)和諸藥，為佐使藥。諸藥共奏補腎活血、燥痰化濁之效。此方肝、脾、腎三臟同調(diào)，以達標本兼治之功。

本實驗采用中藥聯(lián)合糞菌移植方法研究二者聯(lián)合治療PCOS的作用機制，結(jié)果表明，PCOS大鼠雄激素水平升高，卵巢組織HE染色示卵巢呈多卵泡改變，表明PCOS大鼠模型成功建立。模型組大鼠體質(zhì)量、LH/FSH、FPG、HOMA-IR、IL-18、TNF-α水平等均升高，均與PCOS臨床表現(xiàn)一致。中藥組大鼠體質(zhì)量、T、LH/FSH、卵巢內(nèi)小卵泡數(shù)量、FPG、HOMA-IR和IL-18水平等均降低，表明中藥可改善PCOS大鼠生殖功能，改善內(nèi)分泌紊亂、糖代謝紊亂和慢性炎癥狀態(tài)。糞菌移植組PCOS大鼠體質(zhì)量、小卵泡數(shù)量、LH/FSH、IL-18水平均下降，表明單純糞菌移植可調(diào)節(jié)PCOS大鼠內(nèi)分泌，降低炎癥因子水平，但作用有限。中藥+糞菌移植組可顯著改善大鼠生殖和代謝功能，改善慢性炎癥狀態(tài)，其整體改善作用優(yōu)于中藥組和菌群移植組。

有研究表明，PCOS模型大鼠給予益生菌治療后，腸道菌群多樣性恢復(fù)，并改善生殖和代謝功能[12]。此結(jié)果與本實驗結(jié)果一致。提示改善腸道菌群后，PCOS癥狀好轉(zhuǎn)，為從腸道菌群入手治療PCOS提供了新的研究思路。PCOS患者血清中C反應(yīng)蛋白、TNF-α、IL-18、IL-6等炎性介質(zhì)水平升高，提示PCOS存在亞臨床慢性炎癥[13]。且結(jié)果表明，PCOS大鼠卵巢局部炎癥因子TNF-α、IL-18水平較空白組均升高，而升高的TNF-α、IL-18、IL-6均可通過調(diào)控胰島素相關(guān)信號通路，降低胰島素敏感性，引起胰島素累積，如升高的TNF-α可減少胰島素受體底物1的酪氨酸磷酸化，抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo);促進脂肪分解，增加游離脂肪酸，間接影響胰島素敏感性;下調(diào)脂肪細胞中多種重要的信號分子或蛋白表達，導(dǎo)致胰島素累積[14-15]。增多的胰島素進一步導(dǎo)致卵巢產(chǎn)生更多的雄激素，干擾正常卵泡的發(fā)育，促進卵泡閉鎖，從而加劇PCOS。中藥可改善腸道菌群的組成，從而減輕菌群失調(diào)和由此導(dǎo)致的病理現(xiàn)象，如增加益生菌的豐富度，三萜類化合物如人參皂苷、甘草苷、桔梗皂苷等，黃酮類化合物如槲皮苷、黃芩苷等，環(huán)烯醚萜類化合物如當歸苷、芍藥苷等均可增加擬桿菌和雙歧桿菌的豐度[11]。本實驗結(jié)果表明，中藥+糞菌移植組在改善慢性炎癥狀態(tài)方面的作用顯著優(yōu)于中藥組和糞菌移植組。提示聯(lián)合療法可能是通過中藥和腸道菌群的協(xié)同作用，改善腸道微生態(tài)，降低炎癥因子水平，進而緩解胰島素抵抗、降低T水平，抑制卵泡閉鎖，從而起到治療PCOS的作用。

本實驗采用來曲唑造模方法，來曲唑干預(yù)總時間為51 d，模型組大鼠FPG水平顯著升高，但FINS水平未升高，可能與來曲唑干預(yù)時間過短有關(guān)。本實驗?zāi)Ｐ徒MHOMA-IR顯著升高，說明模型組存在胰島素抵抗的表現(xiàn)。在今后實驗中可通過糖耐量試驗、胰島素耐量試驗等多種方法，全方位判斷是否存在胰島素抵抗的現(xiàn)象。

綜上，本實驗采用補腎化濁方聯(lián)合糞菌移植的方法干預(yù)PCOS大鼠，初步探討中藥聯(lián)合糞菌移植對PCOS大鼠的影響及潛在機制。結(jié)果表明，中藥+糞菌移植組可顯著改善大鼠生殖和代謝功能，改善慢性炎癥狀態(tài)，其整體改善作用優(yōu)于中藥組和菌群移植組。聯(lián)合療法的治療作用可能是通過中藥和腸道菌群的協(xié)同作用，改善PCOS腸道微生態(tài)，降低炎癥因子水平實現(xiàn)的。本研究為防治PCOS提供了新思路，可為從腸道菌群入手，以代謝-免疫-內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵分子為靶點，深入探討補腎化濁方治療PCOS的機制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] TEEDE H J， MISSO M L， COSTELLO M F， et al. Recommendations from the international evidence-based guideline for the assessment and management of polycystic ovary syndrome[J]. Human Reproduction， 2018，33（9）：1602-1618.

[2] BALEN A H， MORLEY L C， MISSO M， et al. The management of anovulatory infertility in women with polycystic ovary syndrome：an analysis of the evidence to support the development of global WHO guidance[J]. Human Reproduction Update，2016，22（6）：687-708.

[3] L?VVIK T S， CARLSEN S M， SALVESEN ?， et al. Use of metformin to treat pregnant women with polycystic ovary syndrome （PregMet2）：a randomised， double-blind， placebo-controlled trial[J]. The Lancet Diabetes & Endocrinology，2019，7（4）：256-266.

[4] QI X， YUN C， SUN L， et al. Gut microbiota–bile acid– interleukin-22 axis orchestrates polycystic ovary syndrome[J]. Nature Medicine，2019，25（8）：1225-1233.

[5] 邢玉，劉艷霞，佟慶.中醫(yī)藥辨證治療多囊卵巢綜合征臨床研究進展[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2016，9（7）：887-891.

[6] KAFALI H， IRIADAM M， OZARDALI I， et al. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat：a new modelfor cystic ovarian disease[J]. Arch Med Res，2004，35（2）：103-108.

[7] 黃繼漢，黃曉暉，陳志揚，等.藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9（9）：1069-1072.

[8] SUN W， GUO Y， ZHANG S， et al. Fecal microbiota transplantation can alleviate gastrointestinal transit in rats with high-fat diet- induced obesity via regulation of serotonin biosynthesis[J/OL]. Bio Med Research International，2018，https：//doi.org/10.1155/ 2018/8308671.

[9] MAYER E A. Gut feelings：the emerging biology of gut-brain communication[J]. Nat Rev Neurosci，2011，12（8）：453-466.

[10] INSENSER M， MURRI M， DEL CAMPO R， et al. Gut microbiota and the polycystic ovary syndrome：influence of sex， sex hormones， and obesity[J]. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism，2018，103（7）：2552-2562.

[11] LIU R， ZHANG C H， SHI Y， et al. Dysbiosis of gut microbiota associated with clinical parameters in polycystic ovary syndrome[J]. Frontiers in Microbiology，2017，8：324.

[12] ZHANG F， MA T， CUI P， et al. Diversity of the gut microbiota in dihydrotestosterone-induced PCOS rats and the pharmacologic effects of diane-35， probiotics， and Berberine[J]. Front Microbiol，2019，10：175.

[13] MOHADETHEH M. Immunophenotypic profile of leukocytes in hyperandrogenemic female rat an animal model of polycystic ovary syndrome[J]. Life Sciences，2019，220（3）：44-49.

[14] WANG Y， HE J， YANG J. Eicosapentaenoic acid improves polycystic ovary syndrome in rats via sterol regulatory element-binding protein 1 （SREBP-1）/Toll-Like Receptor 4 （TLR4） pathway[J]. Med Sci Monit，2018，24：2091-2097.

[15] WEBB M A， MANI H， ROBERTSON S J， et al. Moderate increases in daily step count are associated with reduced IL6 and CRP in women with PCOS[J]. Endocrine connections，2018，7（12）：1442-1447.

（收稿日期：2019-08-14）

（修回日期：2019-09-05;編輯：華強）

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金（81904241）;北京中醫(yī)藥大學(xué)青年教師項目（2018-JYBZZ-JS099）

通訊作者：邢玉，E-mail：xingyu465@126.com