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    終板下椎體缺血誘導(dǎo)兔椎間盤退行性變模型的建立及終板中內(nèi)皮素1的表達(dá)

    2020-04-26 20:33:40周小小郭勝洋吳佳俊
    脊柱外科雜志 2020年2期
    關(guān)鍵詞:終板無水乙醇退行性

    袁 維,周小小,蔡 攀,陳 誠,郭勝洋,吳佳俊,錢 明

    1.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院骨科,上海 200081

    2.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院骨科,上海 201318

    3.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院骨科,上海 200003

    椎間盤是人體最大的無血管組織,其營養(yǎng)供應(yīng)通過終板和纖維環(huán)擴(kuò)散入椎間盤內(nèi)。椎體終板通路是椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)的主要途徑,正常椎間盤營養(yǎng)的75%來自椎體終板的滲透,終板發(fā)生退行性變引起椎間盤營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)減少是導(dǎo)致椎間盤發(fā)生退行性變的始動(dòng)因素[1]??菇K板退行性變?yōu)榉乐巫甸g盤退行性變提供了新的思路。修復(fù)椎間盤退行性變的研究前提是建立合適的動(dòng)物模型。目前,較常用的模型建立方法是纖維環(huán)穿刺或穿刺結(jié)合髓核抽吸[2-4],穿刺損傷模型操作較簡單、重復(fù)性好,且退行性變發(fā)展緩慢、便于觀察及干預(yù),但穿刺針的型號(hào)、進(jìn)針的深度需要進(jìn)行精確計(jì)算,其最大的缺點(diǎn)是髓核組織丟失,導(dǎo)致發(fā)生退行性變的過程與自然退行性變有較大的差別,不能全面反映椎間盤退行性變機(jī)制。

    終板退行性變包含一系列復(fù)雜的病理變化,如炎性遞質(zhì)釋放、營養(yǎng)供應(yīng)下降等[5]。發(fā)生退行性變的軟骨終板組織內(nèi)ET-1 呈高表達(dá),并且退行性變的軟骨終板細(xì)胞自身能表達(dá)ET-1,ET-1 作用于軟骨終板細(xì)胞促使其分泌基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、MMP-13 和一氧化氮(NO),導(dǎo)致終板細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原降解,進(jìn)而引起終板退行性變[6]。因此,ET-1 在椎間盤終板退行性變中起著重要作用,可能成為該病治療的新靶點(diǎn)。

    本研究旨在探索一種建立椎間盤退行性變模型的新方法,從營養(yǎng)供應(yīng)障礙方面著手,通過終板下注入醫(yī)用無水乙醇阻斷椎間盤營養(yǎng)供應(yīng),模擬椎間盤退行性變的自然過程。無水乙醇作為微循環(huán)破壞試劑,具有去血管化作用,可使椎體內(nèi)骨髓血管內(nèi)皮細(xì)胞迅速脫水、蛋白質(zhì)變性凝固、小血管閉塞,從而造成微循環(huán)破壞[7-8]。本研究組前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)無水乙醇注射到鼠尾終板下椎體內(nèi)可阻斷椎間盤的主要營養(yǎng)途徑,導(dǎo)致椎間盤退行性變的發(fā)生[9]。本研究選用新西蘭大白兔,將無水乙醇注射到椎體內(nèi)終板下,使滋養(yǎng)血管栓塞缺血、導(dǎo)致椎間盤營養(yǎng)物質(zhì)供給障礙,進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤退行性變,并觀察在終板退行性變過程中ET-1 的表達(dá)情況,為后期終板退行性變的修復(fù)提供切入點(diǎn)及理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要材料、儀器

    健康4 月齡新西蘭兔由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(滬)2018-0040],雌雄不限,體質(zhì)量(3 000±20)g,經(jīng)腰椎X 線和MRI 檢查排除脊柱的先天性疾病和椎間盤退行性變后納入實(shí)驗(yàn)。腰椎骨穿刺針(天津金興達(dá)實(shí)業(yè)有限公司,中國),醫(yī)用無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,中國),氯胺酮、地西泮(福建古田藥業(yè)有限公司,中國),ET-1 抗體(Thermo Scientific,美國)。光學(xué)顯微鏡(Olympus,日本),數(shù)字化計(jì)算機(jī)成像X 線機(jī)和3.0 T醫(yī)用超導(dǎo)型磁共振掃描儀(Philips,荷蘭)。

    1.2 建模方法

    將32 只兔隨機(jī)分為4 組,每組8 只,選取L5,6椎體(對(duì)應(yīng)L4/L5及L5/L6椎間盤)注射300 μL無水乙醇造模,選取L4椎體(對(duì)應(yīng)L3/L4椎間盤)注射磷酸鹽緩沖液(PBS)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照,L7椎體(對(duì)應(yīng)L6/L7椎間盤)未注入任何物質(zhì)作為正常對(duì)照。按3%氯胺酮(30 mg/kg)加0.5%地西泮(2 mg/kg)進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉。將兔右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,在左側(cè)腰背部剃毛備皮,通過左側(cè)腹膜后入路,利用手提式X 線透視儀,側(cè)位透視顯示14G 腰椎骨穿刺針尖位于椎體前2/5 與后3/5 交界處;正位透視下,骨穿刺針在椎體左側(cè)中央處與椎體成45°角斜向下方刺入椎體,緩慢進(jìn)針,至針尖達(dá)終板側(cè)椎體中心,距離終板軟骨約3 mm,將注射液注入椎體骨髓腔內(nèi),速率為50 μL/min,留針6 min,然后緩慢拔針。用4-0 Vicryl 可吸收線縫合切口。于術(shù)前和術(shù)畢肌內(nèi)注射慶大霉素80 000 U,連續(xù)應(yīng)用3 d。術(shù)后連續(xù)3 d 頸部皮下注射卡洛芬(0.2 mg,每日2 次)鎮(zhèn)痛,口服復(fù)方新諾明抗生素藥水(48 mg/mL)1 周后改用正常純凈水。術(shù)后動(dòng)物自由活動(dòng)。

    1.3 X 線檢查測量椎間隙高度

    術(shù)前和術(shù)后1、3、5個(gè)月,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后行X 線檢查。攝影條件:50 mA,50 kV。參照Kim 等[10]的“三中線法”測量椎間隙高度,即在兔腰椎側(cè)位X線片上,選擇最上2 個(gè)和最下2 個(gè)椎體角為標(biāo)記點(diǎn),經(jīng)過這4 點(diǎn)做2 條沿脊柱縱軸方向的直線,再沿相同方向做3 條直線(A、B 及C)均分先前2 條直線間的距離。再將這3 條直線經(jīng)過椎間隙長度分別標(biāo)記為D、E 及F,則該節(jié)段椎間盤高度為(D+E+F)/3。采用Han 等[11]的方法進(jìn)行椎間盤高度指數(shù)(DHI)計(jì)算,即將椎間盤寬度四等分,測量中點(diǎn)及其兩側(cè)各25%位點(diǎn)相鄰椎體及椎間盤的高度。

    1.4 椎間盤退行性變評(píng)估

    術(shù)前和術(shù)后1、3、5 個(gè)月,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后行MRI 掃描。頸椎線圈通過椎間盤矢狀正中切面,采用自旋回波序列(TR:3 000 ms,TE:120 ms)無間距掃描。采用改良Pfirrmann 分級(jí)系統(tǒng)[12]進(jìn)行退行性變程度分級(jí)。所有MRI 影像資料均由3 位資深MRI 醫(yī)師盲法閱片。

    1.5 椎間盤組織病理學(xué)觀察

    術(shù)后1、3、5 個(gè)月,在X 線和MRI 檢查后,各取1 組動(dòng)物給予二氧化碳(CO2)吸入處死。將整個(gè)腰椎完整取出,放入10%中性甲醛溶液中浸泡48 h 后水洗20 min,然后放入脫鈣液(按氯化鋁7 g、濃鹽酸8.5 mL 及甲酸50 mL,加蒸餾水至100 mL 配制)脫鈣4 ~ 5 d,以細(xì)針刺入椎體內(nèi)無阻力為宜。沖洗15 min,于正中矢狀位剖開標(biāo)本,放入50%無水乙醇浸泡后,常規(guī)包埋、制成蠟塊。4 μm 切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色。光學(xué)顯微鏡下觀察終板及椎間盤的組織病理學(xué)變化。

    1.6 終板組織ET-1表達(dá)的檢測

    術(shù)后1、3、5 個(gè)月,收集終板組織進(jìn)行石蠟包埋,制成組織切片,進(jìn)行ET-1 抗體(1∶100)免疫組織化學(xué)染色,檢測PBS 對(duì)照和退行性變終板ET-1 表達(dá)情況。用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行平均光密度定量測定。

    1.7 退行性變軟骨終板細(xì)胞中ET-1表達(dá)的檢測

    術(shù)后1 個(gè)月時(shí),取1 組新西蘭大白兔,無菌情況下獲取退行性變軟骨終板組織,在超凈臺(tái)內(nèi)借助4倍放大鏡仔細(xì)剔除骨屑、髓核和纖維環(huán)殘留組織,PBS 液沖洗獲得較潔白的終板組織。在含有3%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中加入0.15%Ⅱ型膠原酶,過濾除菌后加入終板組織。在10 cm2培養(yǎng)皿中用眼科剪將軟骨終板組織剪碎至約1 mm3大小,移入50 mL 離心管內(nèi),在37℃下200 r/min 振蕩,持續(xù)消化12 h。消化后的混合物用70 μm 濾網(wǎng)過濾,然后以1 200 r/min(離心半徑為160 mm)離心5 min;去除上清液,取沉淀細(xì)胞懸液;加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,1 000 r/min(離心半徑為160 mm)離心5 min,去除上清液,重復(fù)3 次;按細(xì)胞密度約5×105/mL 接種于底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM,每3 d 換液1 次,隔天用倒置顯微鏡觀察、拍照。

    將細(xì)胞接種在12 孔板內(nèi),達(dá)到80%融合時(shí),用PBS 清洗3 次,每次2 min;然后用4%多聚甲醛固定30 min,水洗15 min,雙蒸水洗5 min;室溫下加入甲苯胺藍(lán)染色4 h,再水洗;自然晾干細(xì)胞爬片后,用中性樹膠封片,進(jìn)行軟骨終板細(xì)胞鑒定。

    將已消毒的10 mm蓋玻片置于12孔培養(yǎng)板內(nèi),按5×104/mL的密度接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)進(jìn)行ET-1 抗體(1∶100)免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色,觀察ET-1 的表達(dá)。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以s 表示,不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用方差分析;以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 影像學(xué)評(píng)估椎間盤退行性變情況

    X線片示注射無水乙醇后椎間隙變窄,椎間隙邊緣骨贅增生(圖1)。注射PBS后1、3、5個(gè)月,L3/L4DHI分別為注射前的(99.3±1.1)%、(98.8±1.6)%和(98.2±1.3)%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05);注射無水乙醇后1 個(gè)月,L4/L5和L5/L6DHI 為注射前的(92.1±2.8)%,3 個(gè)月時(shí)降至(72.2±6.5)%,5 個(gè)月時(shí)降至(54.3±6.0)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。

    MRI 示隨觀察時(shí)間延長,注射無水乙醇后L4/L5和L5/L6椎間盤信號(hào)改變明顯(圖2),MRI T2WI 低信號(hào),椎間盤退行性變加劇。按改良Pfirrmann 分級(jí),1 個(gè)月時(shí)為3 ~ 4 級(jí),3 個(gè)月時(shí)為5 ~ 6 級(jí),5 個(gè)月時(shí)為7 ~ 8 級(jí)。

    圖 1 注射無水乙醇后腰椎椎間盤X線影像Fig. 1 Roentgenographs of lumbar disc after injection of absolute ethanol

    圖2 注射無水乙醇后腰椎椎間盤MRI 影像Fig. 2 MRI of lumbar disc after injection of absolute ethanol

    2.2 終板組織學(xué)觀察

    HE 染色結(jié)果顯示:在無水乙醇注射后,終板逐漸出現(xiàn)退行性變,生長板厚度逐漸變薄,進(jìn)而終板結(jié)構(gòu)破損,同時(shí)軟骨終板細(xì)胞退化、直至消失;髓核內(nèi)以脊索細(xì)胞為主,在第1 個(gè)月時(shí)空泡狀細(xì)胞增多,第3 個(gè)月后逐漸轉(zhuǎn)化為以軟骨樣細(xì)胞為主,隨著髓核纖維化進(jìn)展,在第5 個(gè)月時(shí)殘留在纖維組織的髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為纖維軟骨樣細(xì)胞;隨著退行性變加重,纖維環(huán)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)排列紊亂,失去同心圓狀規(guī)則排列,板層松散、斷裂,纖維化程度加重。見圖3。

    2.3 終板組織免疫組織化學(xué)染色

    免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,PBS 對(duì)照近乎陰性表達(dá)(圖4a,光密度為0.012 1±0.000 7)。無水乙醇注射后1 個(gè)月終板軟骨細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯示較強(qiáng)陽性ET-1 表達(dá)(圖4b,光密度為0.257 3±0.024 1),3 個(gè)月時(shí)為陽性表達(dá)(圖4c,光密度為0.192 2±0.015 5),隨著終板退行性變加劇,軟骨細(xì)胞活性降低,第5個(gè)月時(shí)ET-1 表達(dá)下降(圖4d,光密度為0.086 9±0.006 1)。

    2.4 軟骨終板細(xì)胞ET-1 表達(dá)

    提取的軟骨終板細(xì)胞成功進(jìn)行了原代和傳代培養(yǎng),倒置顯微鏡下可見原代細(xì)胞12 ~ 24 h貼壁,48 h后細(xì)胞開始增殖,約7 d 出現(xiàn)細(xì)胞集落,約14 d 鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿,細(xì)胞形態(tài)多樣,從梭形到多邊型不等(圖4e);甲苯胺藍(lán)染色可見細(xì)胞質(zhì)有藍(lán)色異染出現(xiàn)(圖4f);免疫組織化學(xué)染色顯示終板軟骨細(xì)胞內(nèi)ET-1 呈強(qiáng)表達(dá),定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖4g、h)。

    圖 3 注射無水乙醇后腰椎終板、髓核和纖維環(huán)退行性變的病理學(xué)變化(HE 染色)Fig. 3 Pathological changes of lumbar endplate,nucleus pulposus and annulus fibrosus degeneration after injection of absolute ethanol(HE staining)

    圖 4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig. 4 Immunohistochemical staining results

    3 討 論

    椎間盤是脊柱運(yùn)動(dòng)功能單位中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),在解剖上分為終板、髓核和纖維環(huán)3 個(gè)部分,由于其解剖結(jié)構(gòu)特殊,易發(fā)生退行性病變。有研究[13-15]顯示,其發(fā)生機(jī)制包括椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)障礙,炎癥介質(zhì)的釋放,細(xì)胞凋亡、老化和死亡,降解酶活性增高而抑制因子降低,遺傳因素等。上、下終板位于髓核的兩端,具有防止髓核突入椎體、控制椎間盤營養(yǎng)滲透和承接緩沖負(fù)荷的作用,對(duì)維持椎間盤內(nèi)的正常形態(tài)和生理功能具有重要意義。營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)障礙是導(dǎo)致椎間盤退行性變的關(guān)鍵因素。營養(yǎng)供應(yīng)減少后髓核內(nèi)代謝產(chǎn)物排出出現(xiàn)障礙,伴隨降解基質(zhì)酶活性增高,損傷髓核細(xì)胞,髓核處于酸性較高的環(huán)境,這種連鎖反應(yīng)導(dǎo)致退行性變進(jìn)一步加劇。同時(shí),椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)減少會(huì)導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞數(shù)量下降,進(jìn)而細(xì)胞外基質(zhì)(蛋白多糖和Ⅱ型膠原)進(jìn)行性減少,引起椎間盤退行性變[16-18]。此外,有研究顯示,異常應(yīng)力作用可使終板發(fā)生硬化、鈣化及骨化,椎間盤營養(yǎng)供給被阻斷,必然也造成其退行性變[19]。因此,要修復(fù)發(fā)生退行性變的椎間盤,首先要從病因?qū)W上了解退行性變過程及機(jī)制,其中最好的辦法是模擬椎間盤退行性變的自然病程,從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)及生物化學(xué)等多角度進(jìn)行相關(guān)研究,進(jìn)而有的放矢地進(jìn)行干預(yù)治療。

    學(xué)者們從終板損傷的角度對(duì)椎間盤退行性變模型的建立進(jìn)行了一定的探索。Holm等[20]使用3.5 mm鉆頭損傷豬的腰椎終板,鉆頭尖部進(jìn)入髓核內(nèi),3個(gè)月后纖維環(huán)前后部均發(fā)生退行性變,并且纖維環(huán)含水量和髓核蛋白多糖含量明顯減少,證實(shí)終板損傷可致椎間盤退行性變發(fā)生。該模型的缺點(diǎn)是終板損傷的同時(shí)髓核暴露于機(jī)體免疫系統(tǒng),可能激發(fā)一系列自身免疫反應(yīng),難以判斷椎間盤退行性變是由終板損傷還是髓核損傷引起。Iwahashi 等[21]通過被動(dòng)吸煙的方法誘導(dǎo)兔椎間盤退行性變,證實(shí)尼古丁可使椎體-終板附近血管芽的密度降低、管腔變窄,最終導(dǎo)致蛋白多糖和膠原的合成降低。Hutton 等[22]利用骨水泥阻斷一側(cè)或雙側(cè)軟骨終板的血供建立犬腰椎椎間盤退行性變模型,但經(jīng)過70 周的觀察,椎間盤并未出現(xiàn)退行性變,分析其原因?yàn)楣撬鄾]有注射到合適的部位,并沒有阻斷椎間盤的終板營養(yǎng)供給途徑,研究顯示,阻斷終板營養(yǎng)供應(yīng)途徑應(yīng)選擇在中央?yún)^(qū),因?yàn)榻K板中央?yún)^(qū)和全部的纖維環(huán)對(duì)于小分子是滲透性的,而終板接近椎體周緣的外側(cè)區(qū)域是非滲透性的,滲透性得益于骨性終板血管芽的存在,而在終板中央?yún)^(qū)血管芽更為密集。上述研究證實(shí),阻礙椎體-終板營養(yǎng)途徑可使椎間盤發(fā)生退行性變,但造模方法也存在明顯的不足,不能有效推廣應(yīng)用。

    本研究嘗試通過終板下椎體內(nèi)注入醫(yī)用無水乙醇阻礙椎體-終板營養(yǎng)供應(yīng)途徑制作一種新的椎間盤退行性變動(dòng)物模型。無水乙醇注射入椎體后導(dǎo)致終板下血供障礙,首先出現(xiàn)終板退行性變,進(jìn)而影響椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)。組織學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),終板的生長板逐漸變薄,生長板是軟骨終板細(xì)胞密集排列的部位[23],該部位變薄表明終板退行性變加重并逐漸喪失自我修復(fù)的能力。隨著終板結(jié)構(gòu)的退行性變、破壞,軟骨終板骨化程度增加,進(jìn)而椎間盤營養(yǎng)供給減少,髓核內(nèi)細(xì)胞數(shù)量及分泌的細(xì)胞外基質(zhì)也發(fā)生變化,髓核內(nèi)細(xì)胞增殖能力趨于降低,細(xì)胞也發(fā)生轉(zhuǎn)化,已有報(bào)道顯示髓核內(nèi)細(xì)胞從脊索細(xì)胞向軟骨樣細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化是椎間盤退行性變的表現(xiàn)[24-25]。通過對(duì)造模后椎間盤進(jìn)行影像學(xué)、形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察和檢測,結(jié)果顯示符合椎間盤自然退行性變過程,此模型適合于椎間盤退行性變的病因?qū)W研究,為未來臨床干預(yù)治療奠定了理論基礎(chǔ)。

    本研究還發(fā)現(xiàn),ET-1 存在于發(fā)生退行性變的椎間盤終板中,并且被終板軟骨細(xì)胞分泌。注射無水乙醇后1 個(gè)月時(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ET-1 陽性表達(dá),隨著終板退行性變加劇,軟骨終板細(xì)胞活性降低,后續(xù)ET-1表達(dá)下降。有研究[6]證實(shí)ET-1與人椎間盤終板退行性變相關(guān)。針對(duì)ET-1 在椎間盤退行性變中的作用,可嘗試在椎間盤退行性變的早期階段通過鄰近終板的椎體內(nèi)注射ET-1 受體阻斷劑以減弱或阻斷其作用,觀察是否延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤退行性變進(jìn)程,這為修復(fù)退行性變椎間盤開拓了新的方向。

    受實(shí)驗(yàn)條件所限,本研究未對(duì)兔椎間盤退行性變過程中終板鈣化/骨化情況進(jìn)行具體評(píng)估。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將通過注射染料量化分析毛細(xì)血管閉塞情況與終板退行性變的相關(guān)性,并通過熒光標(biāo)記物追蹤小分子物質(zhì)的滲透能力,進(jìn)一步評(píng)估終板退行性變對(duì)椎間盤的影響。

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