“三法三穴”推拿手法對坐骨神經(jīng)損傷大鼠運(yùn)動功能和轉(zhuǎn)化生長因子β1/Smad2通路蛋白表達(dá)的影響

邵帥，莫巖君，于天源，沈熠，羅宇婷，張羽墨，呂桃桃

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京市 100029

周圍神經(jīng)損傷是指周圍神經(jīng)叢、神經(jīng)干或其分支受外力作用，如銳器傷、牽拉傷、擠壓傷等而發(fā)生的損傷，會造成受損神經(jīng)支配區(qū)域運(yùn)動和感覺功能的缺陷。推拿能夠有效促進(jìn)周圍神經(jīng)再生和感覺、運(yùn)動功能恢復(fù)[1-3]。施萬細(xì)胞是周圍神經(jīng)損傷和修復(fù)的主要參與者之一。周圍神經(jīng)損傷后，遠(yuǎn)端神經(jīng)施萬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)闊o髓表型并快速增殖，分泌趨化因子吸引巨噬細(xì)胞到達(dá)受損神經(jīng)殘端，分泌細(xì)胞因子指導(dǎo)軸突再生。推拿能夠有效促進(jìn)神經(jīng)再生，但推拿對施萬細(xì)胞增殖的影響尚缺乏定量研究。

轉(zhuǎn)化生長因子β1 (transforming growth factor β1,TGF-β1)作為施萬細(xì)胞重要的細(xì)胞因子，在損傷早期能夠促進(jìn)施萬細(xì)胞向無髓表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖，同時促進(jìn)瘢痕形成。脈沖電磁場可通過促進(jìn)TGF-β1表達(dá)以促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[4]，但推拿對TGF-β1表達(dá)的影響尚不清楚。本研究觀察“三法三穴”推拿手法對坐骨神經(jīng)損傷(sciatic nerve injury,SNⅠ)大鼠后肢運(yùn)動功能以及坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)施萬細(xì)胞標(biāo)志物S100、TGF-β1及其下游信號Smad2的表達(dá)，以闡釋SNⅠ大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠66只，體質(zhì)量(200±10) g，由北京斯倍福實驗動物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和觀察組，每組22只。本實驗已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。實驗過程對動物的處置遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要儀器與試劑

推拿手法模擬儀：中國專利號200710187403.1。CM 1950冰凍切片機(jī)：德國LEⅠCA公司。Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡：日本NⅠKON公司。電子天平：德國塞多利斯科學(xué)儀器有限公司。蛋白電泳電轉(zhuǎn)系統(tǒng)、Western blotting成像分析儀：美國BⅠO-RAD公司。SpectraMax M2酶標(biāo)儀：美國MOLECULAR DEVⅠCES公司。TS-2000A搖床：中國KYLⅠN-BELL公司。

BCA蛋白濃度測定試劑、TBST、電泳緩沖液、電轉(zhuǎn)液：北京索萊寶生物科技有限公司。SDS-PAGE凝膠預(yù)混液、超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒：蘇州新賽美生物技術(shù)有限公司。TGF-β1兔抗大鼠一抗、GAPDH兔抗大鼠一抗、Smad2兔抗大鼠一抗、S100小鼠抗大鼠一抗、山羊抗兔二抗、含DAPⅠ封片劑：美國ABCAM生物科技有限公司。山羊抗兔熒光二抗(綠色)、驢抗小鼠熒光二抗(紅色)：美國ⅠMMUNOWAY生物科技有限公司。

1.3 模型制備

對模型組和觀察組進(jìn)行坐骨神經(jīng)夾持手術(shù)[3]。1%戊巴比妥鈉3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，備皮消毒后暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，用止血鉗于梨狀肌下緣5mm處滿扣夾持坐骨神經(jīng)5s后縫合。術(shù)后每天固定時間觀察大鼠排便、排尿和進(jìn)食情況。造模后大鼠右后肢癱瘓、蜷縮、跛行為坐骨神經(jīng)夾持損傷模型造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組僅分離后暴露坐骨神經(jīng)5s，不夾持。

1.4 干預(yù)

假手術(shù)組和模型組不干預(yù)。觀察組于造模成功后第8天開始干預(yù)。在不影響傷口愈合的前提下，采用“三法三穴”推拿手法干預(yù)，即每天用推拿手法模擬儀依次在大鼠手術(shù)側(cè)殷門、承山、陽陵泉施行點(diǎn)、撥、揉法，刺激力量為5 N。每法每穴1 min，每只總計9 min。按摩頭為光滑的、直徑10mm的圓形接觸面。每天1次，共21d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic functional index,SFⅠ)[4]

在干預(yù)前和干預(yù)21d，每組取6只大鼠，雙后足染色，放入鋪有打印紙的木槽，待大鼠行走留下3～4對足印。標(biāo)記大鼠手術(shù)側(cè)足為E，正常側(cè)足為N。選擇印跡清晰的足印分別測量足印長度(print length,PL)、足趾寬度(toe spread,TS)、中間足趾距離(intertoes distance,ⅠT)。代入公式[5]。

1.5.2 斜板測試[6]

于干預(yù)前，干預(yù)7 d、14 d、21 d，每組取6只大鼠置于25°斜面上適應(yīng)1 min；之后逐漸增加斜板的角度。當(dāng)大鼠可在一定角度堅持5 s且不滑落，則繼續(xù)增加角度，直至無法在該斜板上堅持5 s。記錄大鼠所能堅持的最大角度。每只測量3次，取均值。

1.5.3 免疫熒光染色

干預(yù)21d，每組取4只大鼠，1%戊巴比妥鈉3.5ml/kg腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛溶液灌注固定后，取右側(cè)坐骨神經(jīng)2cm于30%蔗糖水中脫水、OTC包埋、冰凍切片，厚度12μm。取部分切片，干燥，TBS緩沖液漂洗，封閉劑封閉1 h，加入TGF-β1兔抗大 鼠ⅠgG (1∶50)或Smad2兔抗大鼠ⅠgG (1∶500)、S100小鼠抗大鼠ⅠgG(1∶1000)，過3夜后，避光加入山羊抗兔ⅠgG (1∶1000，綠 色)，驢抗小鼠ⅠgG(1∶500，紅色)，過夜后漂洗，使用含DAPⅠ的封片劑封片，于顯微鏡下觀察損傷神經(jīng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

采用Ⅰmage J圖像分析軟件，在每只大鼠的神經(jīng)圖像中隨機(jī)選擇3個500×500的視野測定積分光密度(integrated optical density,ⅠOD)，取平均值；將TGF-β 1與S100共標(biāo)，觀察TGF-β1的表達(dá)部位與施萬細(xì)胞的關(guān)系；將Smad2與DAPⅠ共標(biāo)，觀察Smad2表達(dá)部位與細(xì)胞核的關(guān)系。

1.5.4 Western blotting

在干預(yù)前，干預(yù)7 d、21 d，每組取6只大鼠，1%戊巴比妥鈉3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，于冰上取損傷點(diǎn)處新鮮坐骨神經(jīng)組織約2 cm，-80 ℃冰箱保存。取出坐骨神經(jīng)標(biāo)本置于研磨棒中，加入組織裂解液，于冰上裂解15min，4 ℃、離心半徑9.5cm、1000r/min離心15min后取上清液，BCA法測定樣本蛋白濃度。將樣品以每孔20μg蛋白為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行上樣，在10%SDSPAGE膠上以80 V電壓電泳至溴酚藍(lán)跑至膠板底部。4 ℃30 V電壓轉(zhuǎn)膜12h。室溫封閉條帶2 h，加入稀釋后的一抗(TGF-β1 1∶500、Smad2 1∶4000、p-Smad2 1∶500、GAPDH 1∶3000)于4 ℃冰箱內(nèi)搖床孵育12 h。TBST洗滌3次，每次5min，加入稀釋后的二抗(1∶3000)于室溫孵育1 h后，TBST洗滌3次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光液曝光，Ⅰmage J圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的ⅠOD。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值為相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SFⅠ

干預(yù)前，模型組和觀察組術(shù)后右足不能著地，SFⅠ低于假手術(shù)組(P＜0.05)。干預(yù)21 d，觀察組SFⅠ高于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點(diǎn)SFI比較

2.2 斜板測試

各時間點(diǎn)，模型組和觀察組斜板測試角度均小于假手術(shù)組(P＜0.05)。干預(yù)21 d，觀察組斜板角度高于模型組(P＜0.05)。見表2。

2.3 免疫熒光染色

三組坐骨神經(jīng)TGF-β1和Smad2表達(dá)均無顯著性差異(P＞0.05)。模型組坐骨神經(jīng)S100表達(dá)明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01)，觀察組高于模型組(P＜0.05)，且與假手術(shù)組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

假手術(shù)組和觀察組髓鞘排列相較于模型組都更加致密有序。Smad2主要表達(dá)在細(xì)胞核周圍。TGF-β1與S100表達(dá)部位存在著較高程度的重合。見圖1、圖2。

2.4 Western blotting

2.4.1 TGF-β1

干預(yù)前和干預(yù)7d，模型組TGF-β1表達(dá)較假手術(shù)組升高(P＜0.05)。干預(yù)7 d，觀察組TGF-β1表達(dá)較模型組降低，但無顯著性差異(P＞0.05)。干預(yù)21d，三組TGF-β1表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。見 表4、圖3。

2.4.2 Smad2

干預(yù)前和干預(yù)7d，模型組Smad2表達(dá)較假手術(shù)組升高(P＜0.05)。干預(yù)7d，觀察組Smad2表達(dá)較模型組降低，但無顯著性差異(P＞0.05)。干預(yù)21d，三組Smad2表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。見 圖4、表5。

2.4.3 p-Smad2

干預(yù)前和干預(yù)7d，模型組p-Smad2表達(dá)較假手術(shù)組升高(P＜0.05)。干預(yù)7d，觀察組p-Smad2表達(dá)較模型組降低，但無顯著性差異(P＞0.05)。干預(yù)21d，三組p-Smad2表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。見圖5、表6。

3 討論

周圍神經(jīng)損傷根據(jù)受損程度分為Ⅰ～Ⅴ度5個級別，Ⅰ度僅為神經(jīng)傳導(dǎo)障礙，Ⅴ度為神經(jīng)干完全斷裂。目前臨床對于周圍神經(jīng)損傷的治療方法主要包括手術(shù)療法[6]、針灸療法[7]、推拿療法[8]和電刺激療法[9]。其中推拿療法作為主要的非手術(shù)療法之一，適用于臨床最常見的Ⅲ度以內(nèi)的周圍神經(jīng)損傷，有著無創(chuàng)傷、無痛苦、不受醫(yī)療條件限制的優(yōu)勢。多項臨床試驗表明，推拿治療周圍神經(jīng)損傷療效顯著。董林林等[10]采用董氏推拿六法(揉法、點(diǎn)法、拿法)治療神經(jīng)根型頸椎病，有效率達(dá)93.33%。錢俊輝等[11]采用羅氏推拿治療腰椎間盤突出癥，愈顯率達(dá)90%。

本研究采用坐骨神經(jīng)擠壓損傷模型，模擬臨床常見的周圍神經(jīng)卡壓損傷，屬于推拿治療適用的Ⅱ度損傷。治療點(diǎn)選用殷門、承山、陽陵泉三穴，分屬足太陽膀胱經(jīng)和足少陽膽經(jīng)所過。殷門位于坐骨神經(jīng)干處，承山位于脛神經(jīng)，陽陵泉位于腓總神經(jīng)；殷門位于股二頭肌，承山位于腓腸肌，陽陵泉位于脛前肌。這三個穴位是能夠同時刺激穴位、神經(jīng)和肌肉的最佳治療點(diǎn)。

表2 各組不同時間點(diǎn)斜板測試角度比較(°)

表3 干預(yù)21 d各組損傷點(diǎn)TGF-β1、Smad2和S100的表達(dá)(ⅠOD)

周圍神經(jīng)損傷后，損傷的遠(yuǎn)端神經(jīng)發(fā)生Wallerian變性，軸突、髓鞘崩解脫失，遠(yuǎn)端神經(jīng)施萬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)闊o髓表型并快速增殖；增殖的施萬細(xì)胞形成Bungner帶，并通過分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子引導(dǎo)軸突生長。王婷等[12]發(fā)現(xiàn)，Bungner帶數(shù)量在損傷后7～15 d到達(dá)高峰。當(dāng)軸突生長進(jìn)入Bungner帶后，施萬細(xì)胞向有髓表型轉(zhuǎn)化，最終形成髓鞘。

TGF-β 是由兩個分子量為12.5 kDa亞單位組成的二聚體，是一種可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生長、分化等細(xì)胞因子。在哺乳動物中，TGF-β1最為普遍。TGF-β1在許多生物學(xué)行為中起關(guān)鍵作用，如炎癥和免疫反應(yīng)、胚胎發(fā)育、傷口愈合、細(xì)胞外基質(zhì)形成和重塑等[13]。TGF-β1在損傷神經(jīng)中主要分布于施萬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[14-16]。施萬細(xì)胞膜表面存在與TGF-β1有高度親和力的受體TGF-βR。TGF-β1通過與TGF-βR結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

TGF-β1與TGF-βR結(jié) 合，Smad2磷酸化為p-Smad2，p-Smad2分子穿過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，在神經(jīng)損傷早期發(fā)揮促增殖作用[17-18]。TGF-β1能促進(jìn)體外純化施萬細(xì)胞增殖。Einheber等[19]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可促進(jìn)純化的施萬細(xì)胞增殖。張平安[20]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TGF-β1可以促進(jìn)純化的施萬細(xì)胞分化和增殖。說明在損傷早期，TGF-β1主要發(fā)揮促施萬細(xì)胞增殖作用。

圖1 干預(yù)21 d各組坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)Smad2表達(dá)(免疫熒光冰凍切片，×400)

圖2 干預(yù)21 d各組坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)TGF-β1、S100表達(dá)(免疫熒光冰凍切片，×400)

圖3 各組神經(jīng)損傷點(diǎn)TGF-β1蛋白表達(dá)(Western blotting)

Chen等[21]發(fā)現(xiàn)，外源性TGF-β1對慢性收縮損傷大鼠神經(jīng)性疼痛具有鎮(zhèn)痛作用。Sulaiman等[22]發(fā)現(xiàn)，外源性TGF-β 與毛喉素合用能夠促進(jìn)周圍神經(jīng)慢性損傷后修復(fù)。裴媛媛等[23]發(fā)現(xiàn)，損傷早期給予外源性TGF-β1能夠促進(jìn)SNⅠ大鼠坐骨神經(jīng)修復(fù)。

表4 各組神經(jīng)損傷點(diǎn)TGF-β1的蛋白表達(dá)(ⅠOD)

表5 各組神經(jīng)損傷點(diǎn)Smad2的蛋白表達(dá)(ⅠOD)

圖4 各組大鼠神經(jīng)損傷點(diǎn)Smad2蛋白表達(dá)(Western blotting)

圖5 各組神經(jīng)損傷點(diǎn)p-Smad2蛋白表達(dá)(Western blotting)

表6 各組神經(jīng)損傷點(diǎn)p-Smad2的蛋白表達(dá)(ⅠOD)

本研究發(fā)現(xiàn)推拿能改善SNⅠ大鼠后肢運(yùn)動功能和精細(xì)動作，這與既往研究結(jié)果相吻合[24]。

本研究通過免疫熒光法對坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)處施萬細(xì)胞標(biāo)記物S100進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)“三法三穴”能夠通過促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖以促進(jìn)髓鞘修復(fù)。郭汝寶[25]發(fā)現(xiàn)，推拿可以促進(jìn)損傷神經(jīng)施萬細(xì)胞的增殖和髓鞘再生。魯夢倩[26]發(fā)現(xiàn)，推拿可明顯促進(jìn)SNⅠ大鼠坐骨神經(jīng)纖維髓鞘的再生，并且能夠促進(jìn)施萬細(xì)胞分泌軸突導(dǎo)向因子Netrin1、Slit2。崔旻珍[27]發(fā)現(xiàn)，推拿可促進(jìn)施萬細(xì)胞分泌層黏連蛋白，降低髓鞘堿性蛋白，促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖，減少髓鞘脫落，從而加快神經(jīng)髓鞘的修復(fù)進(jìn)程。

本研究顯示，TGF-β1主要表達(dá)于坐骨神經(jīng)纖維髓鞘，且Smad2主要在細(xì)胞核周圍表達(dá)。TGF-β1在損傷神經(jīng)內(nèi)表達(dá)量的變化趨勢也與既往研究結(jié)果相吻合。Kim等[28]對SNⅠ大鼠損傷神經(jīng)近端和遠(yuǎn)端TGF-β表達(dá)進(jìn)行時相研究，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端施萬細(xì)胞的TGF-β1在受傷后3 d增加，一直持續(xù)到損傷后28 d神經(jīng)再生結(jié)束。在本研究中，在損傷后7d，模型組TGF-β1在神經(jīng)損傷點(diǎn)的表達(dá)升高，損傷后28 d，模型組與假手術(shù)組無顯著性差異。觀察組坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)TGF-β1/Smad2通路蛋白表達(dá)在干預(yù)后21d與模型組比較無顯著性差異，說明推拿的促髓鞘修復(fù)作用可能與TGF-β 1/Smad2通路無關(guān)。

Western blotting結(jié)果顯示，坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)TGFβ1/Smad2通路的蛋白表達(dá)出現(xiàn)降低趨勢，這可能與神經(jīng)瘢痕形成有關(guān)。周圍神經(jīng)受損后，成纖維細(xì)胞活化增殖，產(chǎn)生大量的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，導(dǎo)致瘢痕形成，阻礙神經(jīng)再生[29-31]。TGF-β1是瘢痕形成的主要影響因子，對神經(jīng)瘢痕的形成有著促進(jìn)作用[32-33]。純化的TGF-β1能夠調(diào)節(jié)與瘢痕形成相關(guān)的組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)和纖溶酶原激活物抑制劑1 (plasminogen activator inhibitor 1,PAⅠ-1)的表達(dá)[34]，而推拿干預(yù)也能調(diào)節(jié)坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)中tPA和PAⅠ-1的含量[35]。還有研究表明[36-37]，機(jī)械刺激能夠通過影響TGF-β1的表達(dá)減輕膠原蛋白及瘢痕形成。據(jù)此推測，本實驗中TGF-β1出現(xiàn)下降趨勢是由于推拿能夠通過調(diào)節(jié)TGF-β1的分泌，影響瘢痕形成。

目前，推拿治療周圍神經(jīng)損傷作用機(jī)理的研究主要圍繞促進(jìn)神經(jīng)再生，對于作為阻礙神經(jīng)再生因素的研究相對偏少，且在周圍神經(jīng)損傷后瘢痕形成方面尚無相關(guān)研究。因此在未來的研究中，除對神經(jīng)瘢痕進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察外，還可以從基因水平層面和轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步探究推拿干預(yù)對神經(jīng)瘢痕形成的影響及機(jī)理。