卜研,史一珺,薛向紅※,趙傳芳,陳杰,廉士珍,朱言柱,胡博
(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,吉林 長(zhǎng)春 130112;2.煙臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心,山東 煙臺(tái) 264003)
犬瘟熱(canine distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)感染犬、狐、貉和水貂等多種肉食動(dòng)物而引起的一種急性熱性、高度接觸性傳染病[1]。該病發(fā)病率高,臨床癥狀多樣,感染后期容易繼發(fā)混合感染,死亡率高達(dá)30%~100%。近年來,CDV自然感染宿主不斷增多。隨著人類對(duì)犬、貓等寵物擁有數(shù)量的增多,犬瘟熱病毒在給動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)、生物多樣化帶來極大損失和危害的同時(shí),還威脅著社會(huì)公共安全[2-3]。
CDV是副黏病毒科麻疹病毒屬成員,其基因組為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA。從基因組3'到5'端依次為3'端前導(dǎo)序列、核蛋白(N)基因、磷蛋白(P)基因、基質(zhì)蛋白(M)基因、融合蛋白(F)基因、血凝素蛋白(H)基因、聚合酶蛋白(F)基因和5'尾隨序列[4-5]。其中,H基因是變異率最高的,是CDV 野毒株分子流行病學(xué)調(diào)查的主要靶基因[6]?;贖基因的多樣性,CDV可分為Asia 1、Asia 2、Europe、European wildlife、America-2、Arctic和America-1 型(又稱疫苗型)。不同基因型犬瘟熱病毒均屬于一個(gè)血清型。我國流行毒株主要是Asia 1,但不同犬瘟熱病毒野毒對(duì)不同種屬易感動(dòng)物致病性差別較大,核苷酸序列存在較大差異,且同CDV-3、Lederle、Onderstepoort 等疫苗株的核苷酸序列同源率較低,為89%~90%。由于犬瘟熱病毒野毒株難以適應(yīng)Vero 細(xì)胞,且經(jīng)過細(xì)胞傳代后,存在毒力降低或丟失[7]。因此,學(xué)者們構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)犬瘟熱病毒受體-信號(hào)淋巴細(xì)胞激活因子(signalling lymphocyte activation molecule,SLAM)的Vero-SLAM細(xì)胞,大大提高了犬瘟熱病毒野毒的分離效率,因此成為目前分離犬瘟熱病毒的首選細(xì)胞[8-9]。但犬瘟熱病毒野毒分離株在Vero-SLAM細(xì)胞上連續(xù)傳代之后是否會(huì)發(fā)生毒力下降尚無報(bào)道。因此,為了快速、精準(zhǔn)獲得CDV 結(jié)構(gòu)基因序列,及時(shí)準(zhǔn)確地追溯犬瘟熱發(fā)病病源和開展CDV 遺傳進(jìn)化分析,本研究設(shè)計(jì)6 對(duì)特異性通用引物,分別對(duì)應(yīng)CDV 毒株的6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因區(qū)域,能夠同時(shí)擴(kuò)增CDV野毒和疫苗毒株,預(yù)測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)未知CDV結(jié)構(gòu)基因的有效擴(kuò)增。該擴(kuò)增體系的建立,還有助于明確CDV 野毒分離株適應(yīng)細(xì)胞前后,其結(jié)構(gòu)基因核苷酸水平和氨基酸水平變異情況,為人們探究CDV 致病機(jī)制、尋找關(guān)鍵毒力位點(diǎn)提供基礎(chǔ),同時(shí),也有望為核酸疫苗和亞單位疫苗研制,及反向遺傳學(xué)系統(tǒng)建立奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 毒株 犬瘟熱病毒野毒HBF-1 株、SD14(7)株,犬瘟熱病毒疫苗毒CDV-3株、OR12株、CDV/R-20/8株,均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所疫病防控研究室保存。
1.1.2 主要試劑和儀器 GeneAmp PCR System 2700、Nanodrop 2000(ThermoFisher);RNeasy Mini Kit(Qiagen);SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis Super-Mix(Invitrogen);質(zhì)粒小量提取試劑盒(Axygen);2 TransStart?FastPfuPCRSuperMix(Transgen);DNAMarker 15 000、DNA Marker 2 000(TaKaRa)。
1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 中公布的23 個(gè)犬瘟熱病毒全基因組序列,具體毒株和GenBank 號(hào)如下:01-2689(AY649446)、007Lm/B(AB490680)、Onderstepoort(AF378705)、CDV SY(KJ466106)、LN(10)1(KP765764)、98-2654(AY466011)、00-2601(AY443350)、SD(14)7(KP765763)、HLJ1-06(JX681125)、98-2646(AY542312)、98-2645(AY445077)、CDV2784-2013(KF914669)、A75 17(AF164967)、Hebei(KC427278)、CDV-3(EU726268)、M25CR/H(AB490681)、50CBI/H(AB490678)、011C/H(AB490674)、PS(JN896331)、Snyder Hill(GU138403)、164071(EU716337)、CDVRD-JL(KJ848781)、CDV-ZC(KJ994343)。對(duì)上述所有毒株的各個(gè)結(jié)構(gòu)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析,利用軟件Primer Premier 5.0 共設(shè)計(jì)6 對(duì)特異性通用引物(序列見表1),用于不同毒株犬瘟熱病毒各個(gè)結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增和序列測(cè)定,預(yù)期6 個(gè)目的條帶大小分別為1 620、1 614、1 048、2 009、1 894、6 600 bp。
1.2.2 不同毒株犬瘟熱病毒RNA提取 根據(jù)RNeasy Mini Kit 操作說明,對(duì)不同毒株犬瘟熱病毒的總RNA進(jìn)行提取。具體操作如下:取犬瘟熱病毒Vero 細(xì)胞培養(yǎng)液200μL,加入350μL RLT 使其充分裂解。之后加入等體積的70%乙醇,吹打混勻。取700μL加入到RN-easy spin column 中,置于 2 mL 收集管中,10 000 r/min 離心 15 s,棄流出液。700 μL Buffer RW1 到 RNeasy spin column 中,10000r/min離心15s,棄流出液。500μL Buffer RPE 到 RNeasy spin column 中,10 000 r/min 離心 15 s,棄流出液。500 μL Buffer RPE 到 RNeasy spin column中,10 000 r/min 離心 15 s,將 RNeasy spin column 置于新的2 mL 收集管中,全速離心1 min。將RNeasy spin column 置于新的1.5 mL 收集管中,在濾膜中間加入40 μL RNase free water 10 000 r/min 離心 1 min,洗脫獲得病毒細(xì)胞懸液的總RNA。
表1 犬瘟熱病毒6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因擴(kuò)增用通用引物序列Table 1 Universal primer sequences for amplification of six structural genes of CDV
1.2.3 不同毒株犬瘟熱病毒cDNA合成 利用Super-ScriptⅢFirst-Strand Synthesis SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以“1.2.2”中獲得的總RNA為模板5μL,50 mmol/L Oligo(dT)1 μL,50 ng/μL Random Hexamers 1μL,Annealing Buffer 1μL,混勻之后在 65 ℃孵育5 min,立即放冰上1 min。之后加入2 First-Strand Reaction Mix 10 μL 和 SuperscriptⅢ RNaseOut Enzyme Mix 2μL 吹打混勻,短離心,在50 ℃孵育50 min。
1.2.4 不同毒株犬瘟熱病毒各個(gè)結(jié)構(gòu)基因擴(kuò)增 根據(jù)普通 PCR 試劑盒 2 TransStart?FastPfu PCR SuperMix的說明操作,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)總體系50 μL包含以下組分:2 TransStart?FastPfu PCR SuperMix 25μL,上游引物 1μL,下游引物1μL,病毒cDNA2μL,ddH2O補(bǔ)齊至 50 μL。設(shè)定 PCR 程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,實(shí)際退火溫度(參照表1 中預(yù)先摸索好的不同引物對(duì)的退火溫度)20 s,72 ℃ 30 s,40 個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。取不同毒株犬瘟熱病毒的N、P、M、F、H 和L 基因的PCR產(chǎn)物5μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,判斷條帶大小,同時(shí)驗(yàn)證引物的特異性、通用性。
1.2.5 犬瘟熱病毒結(jié)構(gòu)基因序列測(cè)定 將野毒HBF-1株和疫苗毒CDV-3 株的6 個(gè)PCR 擴(kuò)增片段進(jìn)行凝膠回收后,所有片段連接至平端載體pEASY-Blunt,利用雙酶切鑒定出正確的重組子,送上海生工進(jìn)行片段序列測(cè)定,最后利用SeqMan進(jìn)行全長(zhǎng)拼接。將HBF-1 株的各個(gè)結(jié)構(gòu)基因序列與GenBank 公布的Hebei 株序列進(jìn)行同源性比對(duì);將CDV-3 株的各個(gè)結(jié)構(gòu)基因序列與GenBank 公布的CDV-3 株序列進(jìn)行同源性比對(duì)。
1.2.6 各個(gè)基因擴(kuò)增用引物對(duì)的特異性 為了明確各個(gè)基因擴(kuò)增用的引物對(duì)是否只能針對(duì)犬瘟熱病毒擴(kuò)增,對(duì)其他種類的犬源病毒(如犬細(xì)小病毒和犬II 型腺病毒)能否實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增,以犬細(xì)小病毒和犬II 型腺病毒DNA 為模板,用之前摸索好的相同條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
利用特異性通用引物(表1),對(duì)犬瘟熱病毒野毒HBF-1 株、SD14(7)株和犬瘟熱病毒疫苗毒CDV-3 株、OR12 株、CDV/R-20/8 株的 cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增。取 5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示,篩選的6 對(duì)特異性通用引物能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)不同毒株的N、P、M、F、H 和L 基因特異性擴(kuò)增,而且獲得目的條帶大小,與預(yù)期一致(圖1~6)。
圖1 犬瘟熱病毒不同毒株N 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of N gene for different strains of CDV
圖2 犬瘟熱病毒不同毒株P(guān) 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of P gene for different strains of CDV
圖3 犬瘟熱病毒不同毒株M 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification of M gene for different strains of CDV
圖4 犬瘟熱病毒不同毒株F 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification of F gene for different strains of CDV
圖5 犬瘟熱病毒不同毒株H 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Amplification of H gene for different strains of CDV
圖6 犬瘟熱病毒不同毒株L 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 Amplification of L gene for different strains of CDV
對(duì)犬瘟熱病毒野毒 HBF-1 株擴(kuò)增獲得的6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因片段,瓊脂糖凝膠電泳后,進(jìn)行膠回收純化。將片段連接至平端載體pEASY-Blunt 上,挑取陽性克隆子送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定,每個(gè)堿基至少測(cè)序6 次以上,確保序列的準(zhǔn)確性。HBF-1 的各個(gè)結(jié)構(gòu)基因序列與2012 年 GenBank 公布的 Hebei 株的對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因序列進(jìn)行比對(duì),由于HBF-1 是Hebei株在Vero-SLAM細(xì)胞上的適應(yīng)株,因此兩者的同源率高達(dá)99.8%~100%。此外,CDV 核苷酸序列具有高變性[10]。本研究設(shè)計(jì)的6 對(duì)引物,能針對(duì)犬瘟熱病毒野毒株HBF-1 的各個(gè)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行準(zhǔn)確擴(kuò)增,獲得6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因的準(zhǔn)確序列。
對(duì)CDV-3 株病毒擴(kuò)增獲得的6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因片段,瓊脂糖凝膠電泳后,進(jìn)行膠回收純化。將片段連接至平端載體pEASY-Blunt 上,挑取陽性克隆子送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定,每個(gè)堿基至少測(cè)序6 次以上,確保序列的準(zhǔn)確性。最后,獲得CDV-3 株的全基因組序列。與2012 年GenBank 公布的CDV-3 株各結(jié)構(gòu)基因序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)同源率高達(dá)99.3%。證實(shí),本研究設(shè)計(jì)的6 對(duì)引物,能針對(duì)犬瘟熱病毒疫苗毒CDV-3 株的6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行準(zhǔn)確擴(kuò)增,獲得其準(zhǔn)確序列。
以犬細(xì)小病毒和犬II 型腺病毒DNA 為模板,用之前摸索好的相同條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結(jié)果如圖7 所示。圖1~6 與圖7,互為陰陽性對(duì)照。
圖7 6對(duì)引物對(duì)犬細(xì)小病毒和犬II型腺病毒基因組的擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 Genome amplification of canine parvovirus and canine adenovirus type II by six pairs of primers
近年來,犬瘟熱病毒自然感染宿主擴(kuò)大,多種野生動(dòng)物,甚至珍稀野生動(dòng)物有報(bào)道感染CDV 而發(fā)病、死亡[11]。學(xué)者們利用細(xì)胞傳代適應(yīng)法獲得了多株犬瘟熱病毒分離株,但是犬瘟熱病毒分離株在Vero 或Vero-SLAM細(xì)胞上連續(xù)傳代之后是否會(huì)發(fā)生毒力位點(diǎn)的突變,這些突變是否會(huì)影響病毒毒力下降尚無明確報(bào)道。因此,準(zhǔn)確獲得犬瘟熱病毒野毒株的6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因序列,對(duì)尋找關(guān)鍵毒力位點(diǎn)至關(guān)重要。另外,及時(shí)準(zhǔn)確地獲取不同毒株(甚至未知毒株)犬瘟熱病毒結(jié)構(gòu)基因序列,有利于分析犬瘟熱病毒遺傳進(jìn)化規(guī)律,追溯犬瘟熱病毒的可能來源。同時(shí),可為核酸疫苗、亞單位疫苗和反向遺傳平臺(tái)的建立奠定基礎(chǔ)。
目前,針對(duì)犬瘟熱病毒各個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的基因擴(kuò)增有一些報(bào)道[12-13],均是針對(duì)一種毒株的。犬瘟熱病毒可以感染很多宿主,實(shí)現(xiàn)跨種屬感染與傳播,犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株基因序列變異率較大,尤其是H 和F 基因序列。因此,為了提高科研效率、節(jié)省科研時(shí)間和避免資源浪費(fèi),本研究設(shè)計(jì)并篩選出6 對(duì)特異性通用引物,一次性精確地實(shí)現(xiàn)了犬瘟熱病毒野毒和疫苗毒株6 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因的通用擴(kuò)增,對(duì)犬細(xì)小病毒和犬腺病毒均無擴(kuò)增,證明了6 對(duì)引物的通用性和特異性。擴(kuò)增過程中,可能因?yàn)椴≡0辶康牟煌嬖跀U(kuò)增亮度的稍微差異,可以通過增加擴(kuò)增體系,實(shí)現(xiàn)大量擴(kuò)增。HBF-1 是狐源犬瘟熱病毒野毒分離株[14],OR12是犬瘟熱病毒貉體適應(yīng)株,可見,本研究設(shè)計(jì)的6 對(duì)通用引物能夠?qū)崿F(xiàn)不同宿主來源的犬瘟熱病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的有效擴(kuò)增。這大大提高了獲得不同毒株犬瘟熱病毒結(jié)構(gòu)基因序列的效率,縮短了獲得其他犬瘟熱病毒未知毒株結(jié)構(gòu)基因序列的時(shí)間。這有助于我們明確犬瘟熱野毒適應(yīng)細(xì)胞前后病毒各個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸序列變異情況,追溯CDV 變異來源和規(guī)律,有助于人類認(rèn)識(shí)犬瘟熱病毒野毒的致病機(jī)制,為尋找犬瘟熱病毒野毒關(guān)鍵毒力位點(diǎn)提供分子依據(jù)。同時(shí),6 對(duì)引物的通用擴(kuò)增,為CDV結(jié)構(gòu)基因的重組構(gòu)建和反向遺傳平臺(tái)中輔助質(zhì)粒的構(gòu)建提供了便利。