冷沉淀析出的原因分析及對策

賈波

（濟(jì)源市中心血站質(zhì)控科，河南 濟(jì)源459000）

冷沉淀（cryoprecipitate CP）是臨床常用的血液成分,主要含有凝血因子Ⅷ （FⅧ）、纖維蛋白原（Fg）、凝血因子 XⅢ（FXⅢ）、血管性血友病因子（vWF）以及纖維連接蛋白（Fn）等成分，廣泛應(yīng)用于手術(shù)、創(chuàng)傷、肝移植、產(chǎn)科出血等引起的凝血機(jī)制障礙，以及血友病A(兒童和輕型成人型)、血管性血友病、Fg缺乏癥等[1-7]。冷沉淀來源于新鮮冰凍血漿(FFP)在1～5℃條件下不溶解的白色沉淀物[8]。其重要特性是37℃融化后呈黃色澄清液體，無色澤異常、破損、析出及重度乳糜[9]，否則可導(dǎo)致冷沉淀報廢。本文結(jié)合實(shí)際工作，對2016年以來冷沉淀報廢情況進(jìn)行統(tǒng)計分析,并進(jìn)一步探討了冷沉淀析出的原因及對策，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 資料來源 報廢冷沉淀來源于臨床供血環(huán)節(jié)，正常對照來源于本站合格庫。

1.1.2 試劑與儀器 因子Ⅷ活性測定試劑 （批號547657A）、APTT 測定試劑 （批號 R7027）、Fg測定試劑（批號 R8041）、CaCL2溶液（批號 R6016）、TC緩沖液（批號 R7019）、清洗液（批號 A8007），以上均由SIEMENS公司提供；標(biāo)準(zhǔn)品（批號503259B，德靈公司）；室內(nèi)質(zhì)控品（自制，采自正常人30人份以上血漿混合分裝，-20℃以下保存）；瑞氏-姬姆薩染色液（批號418033，Baso）；全溫控監(jiān)測智能化血漿解凍儀(Baso);全自動血凝儀（sysmex CA-500）;光學(xué)顯微鏡（萊卡DM500、徠卡6000MB）；電子顯微鏡 (型號：VEGA 3 LMU，TESCAN Czech Republic)；牛鮑氏計數(shù)板（上海醫(yī)學(xué)光學(xué)儀器），大容量計數(shù)池（Nageotte）；血細(xì)胞分析儀（BC-5000 邁瑞）；細(xì)菌培養(yǎng)儀(LABSTAR-50山東鑫科)及配套需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)瓶（批號 20180320、20180301）。

1.2 方法

1.2.1 報廢率分析 統(tǒng)計2016年1月-2018年5月的冷沉淀報廢率(按U計算,1U冷沉淀由400 ml全血以離心法制備),分析引起報廢率增高的主要因素。

1.2.2 細(xì)菌學(xué)檢查 目測發(fā)生析出的冷沉淀,初步判斷有無細(xì)菌污染跡象（氣泡、混濁等）；然后以無菌接駁機(jī)留取析出樣本10 ml于無菌轉(zhuǎn)移袋中，分別接種需氧和厭氧培養(yǎng)瓶中各5 ml，置細(xì)菌培養(yǎng)儀連續(xù)監(jiān)測7d；同步抽取相同批次的庫存冷沉淀進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒別 a、不染色檢查：取析出樣本2 ml于小試管中，將移液器吸頭剪掉3 mm（防止吸不到析出物），然后吸取100 μl代表性樣本，加入Nageotte計數(shù)池，蓋上蓋玻片，以徠卡6000MB熒光顯微鏡鏡檢，200×鎖定析出物拍照后再進(jìn)行630×拍照；b、染色檢查：吸取 100 μl代表性樣本置載玻片上，輕搖動制成直徑約0.5～1.0 cm的涂片，干燥后瑞氏染色，以徠卡DM500顯微鏡油鏡鏡檢拍照，設(shè)正常血涂片和新鮮液體血漿2次離心沉淀物涂片行瑞氏染色為對照；c、電鏡掃描：取析出組和未析出組樣本經(jīng)過液氮冷凍10 min后，冷凍真空干燥24 h，兩組貼于銅臺上經(jīng)離子濺射儀噴金鍍膜，以電子顯微鏡掃描觀察兩組的形態(tài)，加速電壓20 KV。

1.2.4 Ⅷ:C、Fg、PLT檢測 對析出樣本檢測FⅧ:C、Fg、PLT，F(xiàn)Ⅷ:C、Fg 采用全自動血凝儀檢測、即刻法室內(nèi)質(zhì)控規(guī)則，PLT采用血細(xì)胞分析儀和牛鮑氏計數(shù)板檢測(接近血細(xì)胞分析儀檢測下限樣本以牛鮑氏計數(shù)板手工對比檢測),并以正常冷沉淀作為對照組，相同方法檢查FⅧ:C、Fg、PLT，檢測過程嚴(yán)格按照儀器和試劑操作規(guī)程執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理,計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計量資料采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 報廢率統(tǒng)計分析 破損χ2值依次為1.625、0.969、2.921（P 均＞0.05）；乳糜 χ2值依次為 0.042（P＞0.05）、6.550 和 7.902（P 均＜0.01）；析出 χ2值依次為 16.057、1171.261、1121.203（P 均＜0.01）；總報廢率 χ2值依次為 14.214、119.534、1049.531（P 均＜0.01），引起報廢率升高的主要因素為析出,見表1。

表1 冷沉淀報廢率統(tǒng)計分析

2.2 細(xì)菌學(xué)檢查 目測析出冷沉淀無氣泡、無混濁；取析出冷沉淀36 U、同批次庫存冷沉淀24 U，細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒別 析出物呈白色不規(guī)則顆粒漂浮物，輕搖伴云霧狀。a、不染色鏡檢：見條塊狀聚集物內(nèi)散在存在顆粒狀物質(zhì)，并且有游離顆粒存在，見圖1；b、染色鏡檢：見紫紅色顆粒存在，且大塊的紫色條塊狀由小的紫色顆粒組成，血小板染紫紅色，細(xì)顆粒、粗顆粒由數(shù)量不等血小板聚集形成，有游離血小板及碎片存在，見圖2；c、電鏡掃描：經(jīng)凍干掃描，析出組形成一種多孔海綿狀結(jié)構(gòu),表面粗糙，有點(diǎn)狀凸起呈現(xiàn)，呈混合物質(zhì)組成，未析出組為不平整的絮狀結(jié)構(gòu)，表面光滑，呈單一結(jié)構(gòu)特征，見圖3。

圖1 析出物不染色鏡檢（A 200×，B 630×）結(jié)果

圖2 析出物瑞氏染色鏡檢（1000×）結(jié)果：A、B分別為正常血涂片、新鮮液體血漿2次離心沉淀物對照，C、D分別為細(xì)顆粒、粗顆粒析出

圖3 電鏡掃描結(jié)果：A為析出組，B為未析出組

2.4 Ⅷ:C、Fg、PLT檢測 析出組、對照組FⅧ:C比較，t=-2.360，P＜0.05；Fg 比較，t=0.257，P＞0.05；PLT比較，t=4.509，P＜0.01。 見表 2。

3 討論

結(jié)果顯示，2016年1月-2018年5月冷沉淀報廢率呈上升趨勢,其中以析出引起的報廢占主要因素，見表1。目測發(fā)生析出的冷沉淀無氣泡、無混濁，析出物呈白色不規(guī)則顆粒漂浮物，輕搖伴云霧狀，初步分析認(rèn)為：細(xì)菌污染可能性小，可能為纖維蛋白析出，云霧狀是血小板懸液的典型特征。進(jìn)一步檢測：細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果排除細(xì)菌污染導(dǎo)致的析出,對析出物不染色鏡檢見條塊狀聚集物內(nèi)散在存在顆粒狀物質(zhì)，見圖1，瑞氏染色鏡檢見紫紅色顆粒存在,且大塊的紫色條塊狀由小的紫色顆粒組成，血小板染紫紅色，細(xì)顆粒、粗顆粒由數(shù)量不等血小板聚集形成，有游離血小板及碎片存在，見圖2，電鏡掃描見多孔海綿狀結(jié)構(gòu)，表面粗糙，有點(diǎn)狀凸起呈現(xiàn)，呈混合物質(zhì)組成，見圖3，綜合分析析出物應(yīng)為血小板和纖維蛋白聚集體。

表2 析出組、對照組FⅧ：C、Fg、PLT檢測結(jié)果

冷沉淀中血小板主要來源于“制備殘留”。采集的全血經(jīng)低溫大容量成分離心機(jī)分離制備懸浮紅細(xì)胞和新鮮液體血漿時,大多數(shù)血小板隨白膜層保留在懸浮紅細(xì)胞中。因血小板比密 （1.030～1.042）和血漿比密（1.025～1.030）[10]接近，一部分比密低的血小板可保留于血漿中,或者在離心結(jié)束后的減速階段,原本沉降于白膜層的血小板因離心機(jī)共振作用，少量血小板會“蕩起”混入血漿中并用于制備FFP，在隨后以FFP制備冷沉淀的過程，原本存在于總量約為250 ml FFP中的血小板經(jīng)重離心后混入容量為20-30 ml[11]的冷沉淀中，血小板呈“濃縮性增高”（可增高10倍左右）。表2對析出組、對照組血小板含量比較，兩組差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，提示血小板含量與冷沉淀析出存在相關(guān)性。血小板發(fā)生聚集與其活化有關(guān)。引起血小板活化的主要因素有：⑴儲存環(huán)境改變。血小板在22±2℃振蕩保存[12]不會出現(xiàn)聚集，在4℃靜置可以發(fā)生一系列分子生物學(xué)改變，包括由圓盤形變化為球形，并伸出多個偽足，變成樹突型血小板。血小板活化后胞質(zhì)α-顆粒釋放,發(fā)生聚集且表面糖殘基暴露[13]。再經(jīng)復(fù)雜的變化產(chǎn)生凝血酶，使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，并與血小板聚集顆粒纏結(jié)成凝塊。在冷沉淀制備程序中涉及多個4℃的環(huán)節(jié)，分別是全血采集后儲存、新鮮液體血漿的兩次離心、制備冷沉淀前的FFP過夜融化、重離心收集冷沉淀等過程。⑵重離心力。在冷沉淀收集環(huán)節(jié)，F(xiàn)FP中殘留的血小板在重離心力作用下“壓實(shí)”在冷沉淀底部，可促進(jìn)活化的血小板更易與互相交織的纖維蛋白纏結(jié)凝集成團(tuán)。⑶冷凍損傷性活化。血小板冷凍損傷最嚴(yán)重的是血小板破裂成碎片,其次是血小板完整而血小板膜和內(nèi)部的細(xì)胞器等超微結(jié)構(gòu)不完整或移位等。根據(jù)目前的研究[14]，冷凍保存血小板不管是形態(tài)完整還是破壞成碎片,輸入體內(nèi)都有止血作用，只不過與新鮮血小板比較，在體內(nèi)容易被清除。就冷沉淀而言，低溫保存是為了保持凝血因子活性，并不針對血小板進(jìn)行保護(hù)性處理,在速凍-復(fù)融過程中血小板破裂或碎片形成,所含顆粒物質(zhì)釋出。由于血小板釋放出的各種凝血因子仍具有較好的止血作用[15]，從而發(fā)生“冷凍損傷性活化”。此外，冷沉淀富含F(xiàn)Ⅷ:C、Fg成分，高濃度的FⅧ:C、Fg與血小板高殘留量，多因素疊加后發(fā)生析出的幾率增高。從表2析出組與對照組FⅧ:C、Fg比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Ⅷ:C差異有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)g差異無統(tǒng)計學(xué)意義。筆者分析發(fā)生析出的冷沉淀其起始FⅧ:C、Fg含量應(yīng)高于析出后，但在血小板活化聚集及質(zhì)量檢查過程中，因FⅧ:C不穩(wěn)定，部分FⅧ:C被消耗，且消耗比例高于Fg。

需要注意的是，乳糜樣顆粒與析出物在外觀上有相似之處，區(qū)分的方法是取5 ml可疑樣本于小試管中，以3000g離心15 min后觀察，乳糜顆粒消失，取而代之在小試管樣本表層形成白色粘附物，而血小板與纖維蛋白析出物不會消失。

綜合上述我們提出以下對策：⑴降低血小板殘留量。適當(dāng)調(diào)整全血分離紅細(xì)胞和血漿時的離心力、離心時間，降低用于制備冷沉淀的原料FFP中血小板殘留量。⑵減少殘留血小板活化聚集途徑。適當(dāng)調(diào)整重離心收集冷沉淀白色沉淀物的離心力、離心時間,在保證冷沉淀白色沉淀物有效收集（FⅧ:C、Fg含量達(dá)標(biāo)）的前提下，降低血小板殘留量并減輕血小板聚集程度。⑶嚴(yán)格原料FFP篩選。對制備冷沉淀的原料FFP進(jìn)行嚴(yán)格篩選，尤其是外觀尚清晰、僅表現(xiàn)為輕微乳糜的血漿不用于冷沉淀制備。⑷方法學(xué)調(diào)整。采用虹吸法制備冷沉淀的方法無重離心，且容量增加（40～50 ml），F(xiàn)Ⅷ:C、Fg濃度與血小板殘留量均相對降低。⑸控制冷沉淀融化溫度、輸注時間。冷沉淀融化過程避免超溫超時，采用37℃、10min快速融化后應(yīng)盡快輸注，不在室溫或4±2℃冰箱中保存過 久，以減少FⅧ:C損耗及血小板聚集機(jī)會。