陳玉娟,陳雯雯,喬莉蘋,李啟艷,于海英,胡德福,郭學(xué)平
(1.華熙生物科技股份有限公司,山東 濟(jì)南 250101;2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東 濟(jì)南 250101)
透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)是一種可用于皮膚保濕、潤(rùn)滑、修復(fù)的化妝品原料,又稱玻尿酸,用于醫(yī)藥領(lǐng)域時(shí)也稱作玻璃酸。通常應(yīng)用其鈉鹽形式,即透明質(zhì)酸鈉。透明質(zhì)酸是一種酸性黏多糖,廣泛存在于脊椎動(dòng)物組織細(xì)胞間質(zhì)中,其結(jié)構(gòu)是由β-D-葡糖醛酸和β-D-N-乙酰氨基葡糖組成的雙糖單位反復(fù)交替連接而成,分子量范圍可由幾千至幾百萬(wàn)道爾頓。HA是在1934年由美國(guó)科學(xué)家Meyer等[1-3]從牛眼玻璃體中首次分離得到,因其具有良好的潤(rùn)滑性、保濕性和黏彈性,并具有極佳的生物相容性而廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥行業(yè)中。
透明質(zhì)酸鈉含量的經(jīng)典檢測(cè)方法為硫酸-咔唑法[4-5],即使用強(qiáng)酸將透明質(zhì)酸鈉降解成葡糖醛酸,葡糖醛酸與咔唑反應(yīng)形成有機(jī)絡(luò)合物,該絡(luò)合物顯示特有的紫色,其吸光度和糖醛酸的濃度成正比,通過(guò)葡萄糖醛酸的含量可以確定透明質(zhì)酸鈉的含量[6]。由于透明質(zhì)酸雙糖才是透明質(zhì)酸最小結(jié)構(gòu)單元,上述方法只針對(duì)雙糖結(jié)構(gòu)中一部分(葡糖醛酸)進(jìn)行鑒別和定量,專屬性并不強(qiáng)。且一般化妝品通常配方較為復(fù)雜,當(dāng)一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的防腐劑、乳化劑、穩(wěn)定劑等存在時(shí)也可能與硫酸咔唑試劑反應(yīng)顯色在530 nm有特征吸收,采用經(jīng)典的咔唑法作為這些產(chǎn)品的含量檢測(cè)方法專屬性差,會(huì)造成結(jié)果偏差較大,回收率難以達(dá)到要求等問(wèn)題。
微生物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶能將透明質(zhì)酸鈉特異性降解為不飽和雙糖(ΔDiHA)[7],通過(guò)對(duì)供試品中的ΔDiHA進(jìn)行定量來(lái)計(jì)算透明質(zhì)酸鈉含量,即只有供試品為透明質(zhì)酸鈉時(shí),才能產(chǎn)生對(duì)應(yīng)量的ΔDiHA,因此采用酶解法結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)透明質(zhì)酸鈉含量,能排除絕大多數(shù)干擾及假陽(yáng)性,如糖醛酸、有色添加物、能與硫酸咔唑反應(yīng)顯紫紅色的物質(zhì)等,有極強(qiáng)的專屬性,檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
1.1 儀器 梅特勒-托利多AL104型分析天平(0.1 mg);Agilent 1260高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器)。
1.2 試劑與材料 磷酸二氫鈉(分析純);磷酸氫二鈉(分析純);磷酸(分析純);去離子水。
透明質(zhì)酸鈉對(duì)照及供試品(華熙生物科技股份有限公司);透明質(zhì)酸酶(華熙生物科技股份有限公司,≥1 000 IU·mL-1)。
2.1 色譜條件 色譜柱:MCI GEL CK08EH色譜柱(8 mm ×300 mm,5 μm);流動(dòng)相:1%磷酸; 流速:0.6 mL·min-1;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:40 ℃; 檢測(cè)波長(zhǎng):232 nm。
2.2 溶液配制 酶解緩沖液:稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)27.4 g、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)8.8 g置1 000 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,得0.2 mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。上述緩沖液稀釋40倍后得到酶解緩沖液(5 mmol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液,pH 6.0)。
對(duì)照溶液:精密稱取透明質(zhì)酸鈉對(duì)照品約50 mg于50 mL容量瓶中,酶解緩沖液充分溶解并定容至刻度,混勻。取上述溶液0.2 mL,加入0.5 mL透明質(zhì)酸酶,混勻,密封,42 ℃酶解2 h,煮沸2 min使酶失活。將上述溶液轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶中以緩沖液定容至刻度,0.22 μm濾膜過(guò)濾,即得對(duì)照溶液。
供試溶液:精密稱取透明質(zhì)酸鈉供試品約50 mg于50 mL容量瓶中,酶解緩沖液充分溶解并定容至刻度,混勻。取上述溶液0.2 mL,加入0.5 mL透明質(zhì)酸酶,混勻,密封,42 ℃酶解2 h,煮沸2 min使酶失活。將上述溶液轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶中以流動(dòng)相定容至刻度,0.22 μm濾膜過(guò)濾,即得供試溶液。平行制備兩份。
2.4 方法專屬性驗(yàn)證 驗(yàn)證方法:按“2.2”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液及空白溶液(不溶解透明質(zhì)酸鈉),分別取對(duì)照品溶液、空白溶液各20 μL依法進(jìn)樣,記錄色譜圖。可接受標(biāo)準(zhǔn):空白溶液在主峰(不飽和透明質(zhì)酸二糖,ΔDiHA)位置沒(méi)有色譜峰出現(xiàn),主峰兩側(cè)如有相鄰峰,分離度應(yīng)大于1.5[8]。
驗(yàn)證結(jié)果:酶解緩沖液及酶液中的成分均未對(duì)主峰產(chǎn)生干擾,主峰與相鄰峰的分離度為13.0,該方法的專屬性符合驗(yàn)證要求,結(jié)果見(jiàn)表1及圖1。
表1 專屬性驗(yàn)證結(jié)果
2.5 線性和范圍 驗(yàn)證方法:精密稱取透明質(zhì)酸鈉對(duì)照品約50 mg于50 mL容量瓶中,酶解緩沖液溶解并定容至刻度,混勻,制得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取上述母液0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL,分別加入2 mL透明質(zhì)酸酶,混勻,密封,42 ℃酶解2 h,煮沸2 min使酶失活,各轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶中以流動(dòng)相定容至刻度,0.22 μm濾膜過(guò)濾,即得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖。以工作溶液濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線??山邮軜?biāo)準(zhǔn):線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不得小于0.998,Y軸截距應(yīng)在100%響應(yīng)值(5 479.5)的2%(109.6)以內(nèi)。
驗(yàn)證結(jié)果:透明質(zhì)酸鈉濃度與峰面積的線性回歸方程為Y=29.772X-5.046 0,相關(guān)系數(shù)r2=1.000 0,截距為-5.046 0,均符合驗(yàn)證要求。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。
表2 線性結(jié)果
2.6 檢出限(LOD) 驗(yàn)證方法:將對(duì)照溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù),依法進(jìn)樣,記錄色譜圖,計(jì)算主峰信噪比(S/N),當(dāng)S/N≈3時(shí)的濃度為最低檢測(cè)濃度即檢出限。
驗(yàn)證結(jié)果:當(dāng)透明質(zhì)酸鈉濃度為0.04 μg·mL-1時(shí)S/N=4.1,該方法對(duì)透明質(zhì)酸鈉的最低檢出濃度為0.04 μg·mL-1,最低檢出量為0.8 ng,檢出限遠(yuǎn)低于檢測(cè)濃度。
2.7 檢出限(LOQ) 驗(yàn)證方法:將對(duì)照品溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù),依法進(jìn)樣,記錄色譜圖,計(jì)算主峰信噪比(S/N),當(dāng)S/N≈10時(shí)的濃度為最低定量濃度即定量限,將此濃度供試品重復(fù)進(jìn)樣6次,計(jì)算主峰峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,不得大于2%。
驗(yàn)證結(jié)果:當(dāng)透明質(zhì)酸鈉濃度為0.12 μg·mL-1時(shí)S/N=9.8,該方法對(duì)于透明質(zhì)酸鈉的最低檢出濃度為0.012 μg·mL-1,最低檢出量為2.4 ng。將此濃度下的溶液依法重復(fù)進(jìn)樣6次,主峰峰面積RSD為1.7%,符合驗(yàn)證要求。
2.8 重復(fù)性驗(yàn)證 驗(yàn)證方法:平行制備6份供試溶液,依法進(jìn)樣檢測(cè),記錄色譜圖,計(jì)算供試品中透明質(zhì)酸鈉含量及6個(gè)平行樣結(jié)果的RSD??山邮軜?biāo)準(zhǔn):6個(gè)結(jié)果(透明質(zhì)酸鈉含量)的RSD應(yīng)小于2.0%。
驗(yàn)證結(jié)果:6個(gè)供試品平行樣中透明質(zhì)酸鈉含量平均值為97.0%,6個(gè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%,符合驗(yàn)證要求,重復(fù)性驗(yàn)證通過(guò),結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 重復(fù)性結(jié)果
2.9 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 驗(yàn)證方法:精密吸取不含透明質(zhì)酸鈉的空白樣品0.2 mL及1 mL透明質(zhì)酸酶至EP管中,平行配制9份,每3份為1組,每組分別加入“2.2”項(xiàng)下所述對(duì)照母液0.16、0.20和0.24 mL,混勻,密封,42 ℃酶解2 h,煮沸2 min使酶失活,各轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中并定容至刻度。將9份供試溶液各取20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖,以HA檢出量和理論加入量的比值計(jì)算方法回收率??山邮軜?biāo)準(zhǔn):方法回收率為95%~105%,且9個(gè)回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0%。
驗(yàn)證結(jié)果:方法平均回收率為103.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.3%,均符合驗(yàn)證要求,驗(yàn)證通過(guò),驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果
3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 透明質(zhì)酸鈉經(jīng)透明質(zhì)酸酶徹底降解后的產(chǎn)物為透明質(zhì)酸不飽和雙糖,在紫外232 nm有特征吸收,吸收值和ΔDiHA的量呈線性相關(guān)。因此將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為232 nm(見(jiàn)圖3)。
3.2 酶量的選擇 本方法定量是通過(guò)檢測(cè)供試品中降解生成的ΔDiHA的量來(lái)計(jì)算透明質(zhì)酸鈉的含量,因此酶解步驟中加入的透明質(zhì)酸酶應(yīng)保證溶液中的透明質(zhì)酸徹底降解。經(jīng)前期試驗(yàn)摸索,1 mg透明質(zhì)酸鈉應(yīng)至少加入1 000 IU透明質(zhì)酸酶,42 ℃酶解2 h即可徹底降解(232 nm吸收不再增加)。
此方法如應(yīng)用于終端產(chǎn)品,由于配方中的成分可能影響酶活性,因此應(yīng)通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定酶的最佳用量。
3.3 色譜柱的選擇 ΔDiHA的極性較大,分析檢測(cè)一般選用氨基鍵合硅膠柱以鹽溶液為流動(dòng)相,在這種色譜條件下鍵合氨基的水解速度較快,色譜柱耐用性較差。MCI GEL CK08EH是一種陽(yáng)離子交換柱,以水或1%磷酸為流動(dòng)相,適用于小分子有機(jī)酸和小分子糖的分析,柱效高,穩(wěn)定性好,提高了方法的耐用性和經(jīng)濟(jì)性。
本文建立了一種高效液相色譜檢測(cè)透明質(zhì)酸鈉含量的方法,透明質(zhì)酸鈉先經(jīng)透明質(zhì)酸酶徹底降解為ΔDiHA,通過(guò)檢測(cè)ΔDiHA的量計(jì)算透明質(zhì)酸鈉含量。相比于傳統(tǒng)的硫酸-咔唑法,本方法兼具定性及定量的作用,有極強(qiáng)的專屬性。采用酶解法結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)透明質(zhì)酸鈉含量,能排除絕大多數(shù)干擾及假陽(yáng)性,如糖醛酸、有色添加物、能與硫酸咔唑反應(yīng)顯紫紅色的物質(zhì)等,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可信,能更加科學(xué)有效控制原料和終端產(chǎn)品的質(zhì)量。