高效液相色譜法測(cè)定透明質(zhì)酸鈉含量的研究

陳玉娟，陳雯雯，喬莉蘋，李啟艷，于海英，胡德福，郭學(xué)平

(1.華熙生物科技股份有限公司，山東 濟(jì)南 250101；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101)

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是一種可用于皮膚保濕、潤(rùn)滑、修復(fù)的化妝品原料，又稱玻尿酸，用于醫(yī)藥領(lǐng)域時(shí)也稱作玻璃酸。通常應(yīng)用其鈉鹽形式，即透明質(zhì)酸鈉。透明質(zhì)酸是一種酸性黏多糖，廣泛存在于脊椎動(dòng)物組織細(xì)胞間質(zhì)中，其結(jié)構(gòu)是由β-D-葡糖醛酸和β-D-N-乙酰氨基葡糖組成的雙糖單位反復(fù)交替連接而成，分子量范圍可由幾千至幾百萬(wàn)道爾頓。HA是在1934年由美國(guó)科學(xué)家Meyer等[1-3]從牛眼玻璃體中首次分離得到，因其具有良好的潤(rùn)滑性、保濕性和黏彈性，并具有極佳的生物相容性而廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥行業(yè)中。

透明質(zhì)酸鈉含量的經(jīng)典檢測(cè)方法為硫酸-咔唑法[4-5]，即使用強(qiáng)酸將透明質(zhì)酸鈉降解成葡糖醛酸，葡糖醛酸與咔唑反應(yīng)形成有機(jī)絡(luò)合物，該絡(luò)合物顯示特有的紫色，其吸光度和糖醛酸的濃度成正比，通過(guò)葡萄糖醛酸的含量可以確定透明質(zhì)酸鈉的含量[6]。由于透明質(zhì)酸雙糖才是透明質(zhì)酸最小結(jié)構(gòu)單元，上述方法只針對(duì)雙糖結(jié)構(gòu)中一部分(葡糖醛酸)進(jìn)行鑒別和定量，專屬性并不強(qiáng)。且一般化妝品通常配方較為復(fù)雜，當(dāng)一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的防腐劑、乳化劑、穩(wěn)定劑等存在時(shí)也可能與硫酸咔唑試劑反應(yīng)顯色在530 nm有特征吸收，采用經(jīng)典的咔唑法作為這些產(chǎn)品的含量檢測(cè)方法專屬性差，會(huì)造成結(jié)果偏差較大，回收率難以達(dá)到要求等問(wèn)題。

微生物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶能將透明質(zhì)酸鈉特異性降解為不飽和雙糖(ΔDiHA)[7]，通過(guò)對(duì)供試品中的ΔDiHA進(jìn)行定量來(lái)計(jì)算透明質(zhì)酸鈉含量，即只有供試品為透明質(zhì)酸鈉時(shí)，才能產(chǎn)生對(duì)應(yīng)量的ΔDiHA，因此采用酶解法結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)透明質(zhì)酸鈉含量，能排除絕大多數(shù)干擾及假陽(yáng)性，如糖醛酸、有色添加物、能與硫酸咔唑反應(yīng)顯紫紅色的物質(zhì)等，有極強(qiáng)的專屬性，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與材料

1.1 儀器 梅特勒-托利多AL104型分析天平(0.1 mg)；Agilent 1260高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器)。

1.2 試劑與材料 磷酸二氫鈉(分析純)；磷酸氫二鈉(分析純)；磷酸(分析純)；去離子水。

透明質(zhì)酸鈉對(duì)照及供試品(華熙生物科技股份有限公司)；透明質(zhì)酸酶(華熙生物科技股份有限公司，≥1 000 IU·mL-1)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：MCI GEL CK08EH色譜柱(8 mm ×300 mm，5 μm)；流動(dòng)相：1%磷酸； 流速：0.6 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：40 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)：232 nm。

2.2 溶液配制 酶解緩沖液：稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)27.4 g、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)8.8 g置1 000 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得0.2 mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。上述緩沖液稀釋40倍后得到酶解緩沖液(5 mmol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 6.0)。

對(duì)照溶液：精密稱取透明質(zhì)酸鈉對(duì)照品約50 mg于50 mL容量瓶中，酶解緩沖液充分溶解并定容至刻度，混勻。取上述溶液0.2 mL，加入0.5 mL透明質(zhì)酸酶，混勻，密封，42 ℃酶解2 h，煮沸2 min使酶失活。將上述溶液轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶中以緩沖液定容至刻度，0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得對(duì)照溶液。

供試溶液：精密稱取透明質(zhì)酸鈉供試品約50 mg于50 mL容量瓶中，酶解緩沖液充分溶解并定容至刻度，混勻。取上述溶液0.2 mL，加入0.5 mL透明質(zhì)酸酶，混勻，密封，42 ℃酶解2 h，煮沸2 min使酶失活。將上述溶液轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶中以流動(dòng)相定容至刻度，0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得供試溶液。平行制備兩份。

2.4 方法專屬性驗(yàn)證 驗(yàn)證方法：按“2.2”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液及空白溶液(不溶解透明質(zhì)酸鈉)，分別取對(duì)照品溶液、空白溶液各20 μL依法進(jìn)樣，記錄色譜圖。可接受標(biāo)準(zhǔn)：空白溶液在主峰(不飽和透明質(zhì)酸二糖，ΔDiHA)位置沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)，主峰兩側(cè)如有相鄰峰，分離度應(yīng)大于1.5[8]。

驗(yàn)證結(jié)果：酶解緩沖液及酶液中的成分均未對(duì)主峰產(chǎn)生干擾，主峰與相鄰峰的分離度為13.0，該方法的專屬性符合驗(yàn)證要求，結(jié)果見(jiàn)表1及圖1。

表1 專屬性驗(yàn)證結(jié)果

2.5 線性和范圍 驗(yàn)證方法：精密稱取透明質(zhì)酸鈉對(duì)照品約50 mg于50 mL容量瓶中，酶解緩沖液溶解并定容至刻度，混勻，制得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取上述母液0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分別加入2 mL透明質(zhì)酸酶，混勻，密封，42 ℃酶解2 h，煮沸2 min使酶失活，各轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶中以流動(dòng)相定容至刻度，0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不得小于0.998，Y軸截距應(yīng)在100%響應(yīng)值(5 479.5)的2%(109.6)以內(nèi)。

驗(yàn)證結(jié)果：透明質(zhì)酸鈉濃度與峰面積的線性回歸方程為Y=29.772X-5.046 0，相關(guān)系數(shù)r2=1.000 0，截距為-5.046 0，均符合驗(yàn)證要求。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。

表2 線性結(jié)果

2.6 檢出限(LOD) 驗(yàn)證方法：將對(duì)照溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，依法進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算主峰信噪比(S/N)，當(dāng)S/N≈3時(shí)的濃度為最低檢測(cè)濃度即檢出限。

驗(yàn)證結(jié)果：當(dāng)透明質(zhì)酸鈉濃度為0.04 μg·mL-1時(shí)S/N=4.1，該方法對(duì)透明質(zhì)酸鈉的最低檢出濃度為0.04 μg·mL-1，最低檢出量為0.8 ng，檢出限遠(yuǎn)低于檢測(cè)濃度。

2.7 檢出限(LOQ) 驗(yàn)證方法：將對(duì)照品溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，依法進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算主峰信噪比(S/N)，當(dāng)S/N≈10時(shí)的濃度為最低定量濃度即定量限，將此濃度供試品重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算主峰峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，不得大于2%。

驗(yàn)證結(jié)果：當(dāng)透明質(zhì)酸鈉濃度為0.12 μg·mL-1時(shí)S/N=9.8，該方法對(duì)于透明質(zhì)酸鈉的最低檢出濃度為0.012 μg·mL-1，最低檢出量為2.4 ng。將此濃度下的溶液依法重復(fù)進(jìn)樣6次，主峰峰面積RSD為1.7%，符合驗(yàn)證要求。

2.8 重復(fù)性驗(yàn)證 驗(yàn)證方法：平行制備6份供試溶液，依法進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，計(jì)算供試品中透明質(zhì)酸鈉含量及6個(gè)平行樣結(jié)果的RSD?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：6個(gè)結(jié)果(透明質(zhì)酸鈉含量)的RSD應(yīng)小于2.0%。

驗(yàn)證結(jié)果：6個(gè)供試品平行樣中透明質(zhì)酸鈉含量平均值為97.0%，6個(gè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%，符合驗(yàn)證要求，重復(fù)性驗(yàn)證通過(guò)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性結(jié)果

2.9 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 驗(yàn)證方法：精密吸取不含透明質(zhì)酸鈉的空白樣品0.2 mL及1 mL透明質(zhì)酸酶至EP管中，平行配制9份，每3份為1組，每組分別加入“2.2”項(xiàng)下所述對(duì)照母液0.16、0.20和0.24 mL，混勻，密封，42 ℃酶解2 h，煮沸2 min使酶失活，各轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中并定容至刻度。將9份供試溶液各取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以HA檢出量和理論加入量的比值計(jì)算方法回收率?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：方法回收率為95%～105%，且9個(gè)回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0%。

驗(yàn)證結(jié)果：方法平均回收率為103.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.3%，均符合驗(yàn)證要求，驗(yàn)證通過(guò)，驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 透明質(zhì)酸鈉經(jīng)透明質(zhì)酸酶徹底降解后的產(chǎn)物為透明質(zhì)酸不飽和雙糖，在紫外232 nm有特征吸收，吸收值和ΔDiHA的量呈線性相關(guān)。因此將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為232 nm(見(jiàn)圖3)。

3.2 酶量的選擇 本方法定量是通過(guò)檢測(cè)供試品中降解生成的ΔDiHA的量來(lái)計(jì)算透明質(zhì)酸鈉的含量，因此酶解步驟中加入的透明質(zhì)酸酶應(yīng)保證溶液中的透明質(zhì)酸徹底降解。經(jīng)前期試驗(yàn)摸索，1 mg透明質(zhì)酸鈉應(yīng)至少加入1 000 IU透明質(zhì)酸酶，42 ℃酶解2 h即可徹底降解(232 nm吸收不再增加)。

此方法如應(yīng)用于終端產(chǎn)品，由于配方中的成分可能影響酶活性，因此應(yīng)通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定酶的最佳用量。

3.3 色譜柱的選擇 ΔDiHA的極性較大，分析檢測(cè)一般選用氨基鍵合硅膠柱以鹽溶液為流動(dòng)相，在這種色譜條件下鍵合氨基的水解速度較快，色譜柱耐用性較差。MCI GEL CK08EH是一種陽(yáng)離子交換柱，以水或1%磷酸為流動(dòng)相，適用于小分子有機(jī)酸和小分子糖的分析，柱效高，穩(wěn)定性好，提高了方法的耐用性和經(jīng)濟(jì)性。

本文建立了一種高效液相色譜檢測(cè)透明質(zhì)酸鈉含量的方法，透明質(zhì)酸鈉先經(jīng)透明質(zhì)酸酶徹底降解為ΔDiHA，通過(guò)檢測(cè)ΔDiHA的量計(jì)算透明質(zhì)酸鈉含量。相比于傳統(tǒng)的硫酸-咔唑法，本方法兼具定性及定量的作用，有極強(qiáng)的專屬性。采用酶解法結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)透明質(zhì)酸鈉含量，能排除絕大多數(shù)干擾及假陽(yáng)性，如糖醛酸、有色添加物、能與硫酸咔唑反應(yīng)顯紫紅色的物質(zhì)等，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可信，能更加科學(xué)有效控制原料和終端產(chǎn)品的質(zhì)量。