星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)選全蝎剛毛顯微特征常數(shù)測定條件

王迎夏,楊濤,彭振瑜,張靜偉,劉孟瑜,陳聰慧

(臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東 臨沂 276000)

全蝎，中藥名，為鉗蝎科動物東亞鉗蝎(ButhusmartensiiKarsch)的干燥體，辛，有毒。具有熄風(fēng)鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛之功效?！吨袊幍洹?015年版收錄性狀：本品頭胸部與前腹部呈扁平長橢圓形，后腹部呈尾狀，皺縮彎曲，完整者體長約6 cm。頭胸部呈綠褐色，前面有1對短小的螯肢和1對較長大的鉗狀腳須，形似蟹螯，背面覆有梯形背腹面有足4對，均為7節(jié)，末端各具2爪鉤；前腹部由7節(jié)組成，第7節(jié)色深，背甲上有5條隆脊線。背面綠褐色，后腹部棕黃色，6節(jié)，節(jié)上均有縱溝，末節(jié)有銳鉤狀毒刺，毒刺下方無距。氣微腥，味咸。全蝎粉末呈淡黃色至棕黃色，微腥。剛毛呈棕黃色，完整或短碎存在，靠近基部呈淡黃白色至白色變化，較平直，近基部稍膨大，毛干具有明顯的直線型縱向紋理?？捎诠鈱W(xué)顯微鏡10倍鏡下觀察，具有生物學(xué)穩(wěn)定特征，易于觀察計數(shù)(見圖1)。主產(chǎn)于河南、山東、河北、遼寧等地。

目前國內(nèi)多采取正交設(shè)計或均勻設(shè)計法優(yōu)化顯微常數(shù)測定條件[1-4]，這兩種方法多采用線性數(shù)學(xué)模型，雖有簡便、試驗次數(shù)較少等優(yōu)點，但精度不太高。星點設(shè)計是在析因設(shè)計的基礎(chǔ)上，加上星點及中心點而形成的試驗設(shè)計方法，該法采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，在中心點進(jìn)行重復(fù)性試驗以提高試驗精度，預(yù)測值更接近真實值且簡便，試驗次數(shù)較少[5-8]。本試驗以顯微常數(shù)RSD值為指標(biāo)，引入星點試驗設(shè)計方法，結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)選全蝎剛毛顯微常數(shù)測定條件，旨在優(yōu)化全蝎剛毛顯微特征常數(shù)測定條件的同時，為探討該試驗設(shè)計法進(jìn)一步應(yīng)用優(yōu)選全蝎剛毛顯微特征常數(shù)測定條件可行性提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ME104萬分之一電子分析天平(深圳市盛美儀器有限公司)；Olympus CX-41生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；KQ3200DV超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；QE-100高速中藥粉碎機(浙江屹立工貿(mào)有限公司)。

1.2 材料 甘油、水合氯醛(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)均為分析純；試驗用水合氯醛試液均按照《中國藥典》2015年版(一部)附錄配置。

全蝎來源于臨沂市各大藥房，因來源不同各個藥店的全蝎質(zhì)量均有略微差異。所有試驗樣品經(jīng)臨沂大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室陳聰慧老師鑒定為全蝎正品。具體來源見表1。

表1 全蝎樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 載玻片試液體積的選擇 精選完整的大小接近的優(yōu)質(zhì)全蝎在磨藥器中充分研磨0.5 min，然后過80目篩得到全蝎粉末,根據(jù)表3分別精密稱取全蝎粉末9份，用水合氯醛試液多次水飛，移入25 mL容量瓶，根據(jù)表3加入不同量的甘油，最后用水合氯醛試液定容混勻。用移液槍吸取試液滴到載玻片上，用蓋玻片蓋住測出不同條件的試液完全被蓋玻片所覆蓋同時又不溢出時的體積求得平均值。以平均值作為移液槍吸取的體積。經(jīng)過試驗，選定0.04 mL為每張玻片所用樣品試液的最適體積。

2.2 目篩的篩選 根據(jù)分析得到影響顯微常數(shù)的3個因素為甘油量、全蝎的質(zhì)量、目篩的大小，因為星點設(shè)計需要的是連續(xù)的變量，所以目篩的大小在做星點設(shè)計之前需要篩選出來，通過固定其他兩個因素不變，改變目篩的選擇，做預(yù)試驗選出需要的目篩。分別稱取過65目篩、80目篩、100目篩的全蝎粉末500 mg加水合氯醛試液少量水飛，移入25 mL容量瓶，加10 mL甘油，用水合氯醛試液定容充分搖勻，分別取0.04 mL進(jìn)行顯微裝片，每份樣品溶液平行裝片30張，觀察剛毛個數(shù)并記錄。測出每份樣品的RSD值，試驗結(jié)果見表2，選出目篩為65目。

表2 各目篩混勻度RSD值

2.3 星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法條件優(yōu)化設(shè)計 根據(jù)文獻(xiàn)報道及顯微常數(shù)的測定方法[9-13]，確定顯微常數(shù)測定條件的考察因素為全蝎粉末量、甘油量、目篩的大小。由于目篩為非連續(xù)變量，回歸處理較困難，結(jié)合預(yù)試驗結(jié)果定為 65目篩，其余因素的水平據(jù)預(yù)試驗結(jié)果而定，全蝎的質(zhì)量范圍為100～700 mg,甘油的體積范圍為2～10 mL以全蝎剛毛個數(shù)的RSD值為考察指標(biāo)，采用星點設(shè)計優(yōu)化顯微常數(shù)測定條件，水平取值為0、±1、±λ，λ=(F)1/4，F(xiàn)為析因設(shè)計部分試驗次數(shù)，F(xiàn)=k2(k為因素數(shù))或者F=k2×(1/2)(一般5因素以上采用)，因素水平見表3，試驗安排見表4。

表3 測定條件星點設(shè)計因素水平

表4 測定條件星點試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)表3取老百姓大藥房全蝎粉末共13份，用水合氯醛試液多次水飛，移入25 mL容量瓶，依據(jù)表3加入不同量甘油，用試驗用水合氯醛試液定容，充分搖勻后，精密吸取0.04 mL進(jìn)行裝片，每份樣品平行裝片30張，于顯微鏡下觀察并記錄剛毛數(shù)，求其RSD值，將試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0和OriginPro 9.1進(jìn)行二元線性及非線性擬合做數(shù)據(jù)對比畫出函數(shù)三維圖分析優(yōu)化全蝎剛毛顯微特征常數(shù)測定條件，根據(jù)條件求出全蝎剛毛顯微特征常數(shù)值。

2.3.1 二元線性分析 結(jié)果用SPSS 19.0輸入數(shù)據(jù)處理得到由二元線性分析得到函數(shù)關(guān)系式：Y=-0.025X1+0.219X2+30.878，R2=0.347，P=0.118(P>0.05)，擬合度很差且顯著性不好。

2.3.2 二元非線性擬合 結(jié)果用OriginPro 9.1進(jìn)行二元非線性擬合，剔除相關(guān)性差的組分，再次進(jìn)行二元非線性擬合，得到結(jié)果函數(shù)關(guān)系式為Y=38.894 68-0.025 04X1-4.366 57X2+0.000 025 308 6X12+0.379 86X2-0.000 503 808X1X2，R2=0.753 45，P=0.000 098(P<0.01)(X1代表全蝎用量、X2代表甘油量)，擬合度較好，顯著性高。

2.3.3 響應(yīng)曲面圖 用OriginPro 9.1軟件繪制二次多項式模型中兩因素對評價指標(biāo)RSD的三維效應(yīng)曲面圖(見圖2)，可直觀地反映各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，有助于確定最佳顯微常數(shù)測定條件范圍。

2.3.4 條件優(yōu)化與預(yù)測因變量 曲面圖是三維圖，能表達(dá)含兩個自變量的函數(shù)，基于已建立的函數(shù)模型，對全蝎的顯微特征常數(shù)測定條件進(jìn)行最優(yōu)化設(shè)計，為使試驗設(shè)計結(jié)果Y值(RSD值)最小，可得到當(dāng)全蝎用量為556 mg，甘油量為5.8 mL時，混勻度最好，RSD最低值為18.586 5%，最終選取優(yōu)化條件為全蝎556 mg,甘油量為6 mL。

2.4 驗證試驗 為了確定建立的模型與試驗結(jié)果是否相符，通過進(jìn)一步試驗對結(jié)果模型可靠性進(jìn)行驗證，驗證試驗中各因素的取值為上述的優(yōu)化條件，分別對5家藥店的全蝎進(jìn)行試驗測定，得到結(jié)果見表5。將得到的值與預(yù)測值做比較，偏差結(jié)果見表6。

表5 全蝎中剛毛數(shù)值測定的星點設(shè)計驗證試驗結(jié)果

表6 各全蝎樣品優(yōu)化條件結(jié)果與預(yù)測值偏差

結(jié)果表明,實際值與預(yù)測值偏差較小，說明模型可靠，用效應(yīng)面法來優(yōu)化全蝎的剛毛顯微特征常數(shù)測定條件是可行的。

2.5 全蝎各樣品剛毛顯微特征常數(shù)值測定 按照設(shè)計結(jié)果分別精密稱取全蝎5種樣品粉末，水合氯醛試液多次水飛，移入25 mL容量瓶中，加入優(yōu)化甘油量，用水合氯醛試液定容搖勻。精密吸取溶液0.04 mL，分別平行裝片30張，觀察剛毛并計數(shù)，按公式(1)計算全蝎剛毛顯微特征常數(shù)值(P)，結(jié)果見表7。

P=(X × V)/(V′× W)

(1)

式中：W-樣品質(zhì)量(mg)；V-定量樣品混懸液總體積(mL)；P-定量樣品顯微特征常數(shù)值(個/mg)；V′-蓋玻片下樣品混懸液體積(mL)；X-每片蓋玻片下樣品顯微剛毛數(shù)。

表7 各全蝎樣品剛毛顯微特征常數(shù)數(shù)值測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗采用556 mg的全蝎粉末，6 mL的甘油量對全蝎的剛毛顯微特征常數(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果精確度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好。對顯微常數(shù)的測定常用的正交設(shè)計與均勻設(shè)計，這兩種方法試驗次數(shù)少，操作簡便，但是得到的結(jié)果精確度不高，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性差，難以全面反映自變量與因變量之間的相關(guān)性，本試驗采用星點設(shè)計效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化全蝎剛毛的顯微常數(shù)測定條件，得到的結(jié)果與預(yù)測值非常接近，混勻度高，說明采用星點設(shè)計建立的數(shù)學(xué)模型優(yōu)化顯微常數(shù)測定條件是可行的，對于目篩的選用是顯微常數(shù)測定的因素之一，因為為非連續(xù)變量，所以在采用星點設(shè)計前，先通過確定其他因素不變改變目篩得到混勻度結(jié)果最好的目篩來進(jìn)行下面的星點設(shè)計。